革兰氏阳性细菌质粒DNAout
产品及特点 本试剂盒是用于从革氏阳性(G+)细菌种小量制备质粒 DNA。本产品基于改良后 的碱变性法,首先菌体经溶菌酶破壁,然后碱裂解法处理使基因组 DNA 和质粒 DNA 均变性,再用酸中和,质粒 DNA 客户快速复性,而基因组 DNA 不能快速复性,故 可以通过离心去除,除去后含质粒的上清用离心吸附柱吸附质粒 DNA,洗去杂质, 即可得到纯化的质粒 DNA。本产品具有下列特点:
1. 快速、步骤少,整个操作在 40 分钟左右完成。
2. 不需要预平衡离心吸附柱。
3. 通用洗柱液即开即用,不需要用户额外加乙醇。
4. 溶液 B 中有蓝色染料,便于目测非常关键的碱变性和中和反应两步的溶液混匀状 况,保证实验效果。
5. 产量高,一次可以处理 1-4 mL 过夜培养的 G+菌液,每毫升过夜培养的 G+细 菌可以提取到 2-5 ug/mL(取决于质粒是高拷贝、中拷贝还是低拷贝)。
6. 纯度高,采用本试剂盒提取的质粒 OD 比值在 1.8-2.0 之间,可以直接用于酶切、 转化、测序及 PCR 等。
革兰氏阳性细菌质粒DNAout
规格及成分 成 份 编 号 大纸盒包装
革氏阳性质粒 DNAout 溶液 A 120601a 13 mL
革氏阳性质粒 DNAout 溶液 B 120601b 13 mL
革氏阳性质粒 DNAout 溶液 C 120601c 18 mL
溶菌酶干粉(20KU/mg) 80103c 30mg(黄盖)
RNase A 溶液,10mg/mL 3160 0.6 mL
通用洗柱液 60408 50 mL
DNA 洗脱液 2.0 111205 10 mL
离心吸附柱 60911 50 套
使用手册 60205sc 1 份
革兰氏阳性细菌质粒DNAout运输及保存 常温运输和保存,RNase A 溶液需要-20℃保存,有效期一年。 自备试剂 无
使用方法 1. 从筛选平板上挑取单菌落至含抗生素的培养基中,37℃震荡培养 12-16 小时(摇 床转速 200-300)。注意:建议使用 LB 培养基,营养更丰富的培养基会使菌体 浓度过高,超过纯化系统处理能力而降低 DNA 质量。另外,延长培养时间会因 细胞死亡、裂解而造成质粒 DNA 浓度降低。
2. 用 1.5 mL 离心管收集 1-4 mL 过夜培养饱和菌液,室温 12,000 rpm 离心 1 分钟,弃上清,再短暂离心,吸弃残留液体。
3. 次使用本试剂盒时,先将全部 RNase A 溶液全部加入到革氏阳性质粒 DNAout 溶液 A(简称溶液 A,下同)中,摇匀后再取用,未用完的溶液 A 放 4℃ 保存。
4. 加入 250 uL 溶液 A,用枪头充分吹打使菌体重悬。注意:细胞未充分悬浮会影 响后续碱变性,可以使用漩涡振荡器混匀或使用枪头吸头吹打沉淀至完全混匀。
5. 加入大约 5 mg 溶菌酶干粉(用 0.1mg 精度的分析天平称量),轻柔颠倒混匀后 室温放置 10 分钟破裂细胞壁。
6. 加入 250 uL 革氏阳性质粒 DNAout 溶液 B(下面简称溶液 B,如果溶液 B 在 低温放置产生沉淀,须 37℃加热溶解后冷却到室温方可使用),温和反复颠倒混 匀看到溶液的蓝色变得均匀并且溶液变粘即可(一般需要颠倒 4-6 次),然后冰 上放置不超过 5 分钟。注意:冰上放置不要超过 5 分钟,否则质粒 DNA 会有碱 损伤。千万不要剧烈振荡,否则基因组 DNA 断裂产生的片段非常容易污染质粒 DNA。溶液 B 用后需要将盖拧紧存放,否则空气中的二氧化碳会进入溶液,形 成碳酸,中和溶液 B 中的碱,降低其效率。如果溶液 B 颜色不是蓝色,则表示 变质,应该弃之不用并且速跟厂家联系。
7. 加入 350 uL 冰上预冷的革氏阳性质粒 DNAout 溶液 C(下面简称溶液 C),温 和反复颠倒直到溶液颜色变成无色(一般需要颠倒混匀 4-6 次)。混匀后可见白 色沉淀物产生,然后冰上放置至少 5 分钟让质粒 DNA 复性。
8. 12,000 rpm 离心 3 分钟,小心将上清液转移到离心吸附柱中。由于此时的溶液 比重较大,部分沉淀物悬浮在上清液中属正常,吸取上清时避开漂浮的沉淀物即 可。如果此步的离心在 4℃进行,可减轻沉淀物漂浮。
9. 静置 2 分钟以让质粒 DNA 与离心吸附柱充分结合,保证静置不少于 2 分钟十分 重要。
10. 室温 12,000 rpm 离心 1 分钟,弃收集管中的废液。
11. 加入 500 uL 的通用洗柱液到离心吸附柱中,室温 12,000 rpm 离心 1 分钟, 弃收集管中废液。注意:通用洗柱液中含乙醇,每次用后需要将盖拧紧存放,否 则乙醇会挥发。
12. 重复上步 1 次。
13. 室温 12,000 rpm 离心 1 分钟,甩干残留液体。此步不能省略,否则残留乙醇 会影响 DNA 的后续使用(如残留乙醇使 DNA 溶液在电泳上样时不能沉淀到加 样孔中)。
14. 将离心吸附柱置于一个新的 1.5 mL 塑料离心管(自备)中,加入 30-100 uL 65-80℃预热的 DNA 洗脱液 2.0,室温放置 2 分钟。常温的 DNA 洗脱液 2.0 也可以用于洗脱,但产量稍微有所降低。
15. 室温 12,000 rpm 离心 1 分钟,离心管底溶液即质粒 DNA。
16. 由于基因的吸附柱结合 DNA 能力较强,如果再加适量 DNA 洗脱液 2.0 到 离心吸附柱中,往往还能洗脱下很多质粒 DNA(相当于次洗脱的 20-30%), 但注意不要使用上步得到的 DNA 洗脱液 2.0 来洗脱。