柱式真菌RNAout

柱式真菌RNAout

产品及特点本产品本产品是在本公司真菌 RNAout（CAT#:60305）基础上改进的柱式产品，跟真菌 RNAout 相比，它具有下列特点：

1. 柱式操作，更加简单快捷，整个过程只需要约 30 分钟。

2. RNA 纯度高，OD260/280 一般都在 2.0 左右，可直接用于 RT-PCR、Norther 杂交、microarrayhybridization、cDNA 合成等。

3. RNA 产量高，一般在 20-70 ug/mL 酵母培养物(约 2.0 ×107个细胞)。

4. 非酶细胞破裂法，适用于各种形态和各个种属的真菌及革兰氏阳性细菌，包括 Candida albicanSaccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomycespombe、Pichiapastoris、Bacillussubtilis、Staphylococcusaureus 等。
柱式真菌RNAout
规格及成分 成 分 编号 50 次包装
溶液 A 80804A 20 mL 溶液 B 80804B 25 mL 溶液 C 80804C 75 mL 溶液 D 80804D 25 mL 离心吸附柱 60911 50 套 通用洗柱液 60408 50 mL RNA 洗脱液 71207 10 mL 使用手册 1 份 

柱式真菌RNAout运输及保存 常温运输，4℃保存，有效期一年。自备试剂 氯仿。

使用方法 1. 将 50 mg 左右的干菌丝(或 100 mg 左右的鲜菌丝、或适当数量的真菌

菌落)转移到 1.5 mL 塑料离心管中。如果是液体真菌培养物，则直接将

1-10 mL 液体真菌在 1.5 mL 塑料离心管中 12000-15000 g 离心 1 分钟，并弃尽液体培养基（可以分多次离心）。

2. 加入 0.4 mL 溶液 A 并充分吹打混匀。如果 A 溶液存放时产生沉淀，请置于 65℃融化，用前充分摇晃均匀。

3. 加入 0.4 mL 溶液 B，剧烈振荡 30 秒。

4. 65℃保温 5 分钟。

5. 室温 12000-15000 g 离心 3-5 分钟，转移上清到一干净的 1.5 mL 塑料离心管中。

6. 再加入 0.1 mL 溶液 B 和 0.1 mL 自备氯仿，振荡混匀 30 秒。

7. 室温12000-15000 g离心3-5分钟，转移上清到一自备的、干净的5 mL塑料离心管中。

8. 加入相当于上清 3 倍体积的溶液 C（约 1.2-1.5 mL）和 1 倍体积的溶液 D（约 0.4-0.5 mL），充分混匀。

9. 将 混合 液（约 2.5mL）分 3-4 次转 移 到 离心 吸 附 柱 中。 每次13000-15000 g 室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。

10. 用 0.5 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。

11. 一次洗涤一般足够去除杂质。但如果样品 OD260/280 比值不高，可以再用 0.5 mL 通用洗柱液重复此步一次。

12. 室温离心半分钟。此步十分重要，否则残留的洗柱液会影响 RNA 的使用。

13. 将离心吸附柱转移到一自备的 RNase-free 1.5 mL 塑料离心管中，加入30-100 uL RNA 洗脱液。

14. 室温离心半分钟，离心管中溶液即为 RNA 样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。

15. RNA 完整性的电泳检测：

如果需要做 Northern 杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行 RNA 电泳，因为非变性胶不能分离所有的 RNA 分子（BioTechniques，28：414，2000）。如果是简单检测，可以使用 TAE 或基因的SuperBuffer-2 DNA/RNA 两用快速电泳液，但文献报道必须使用变性上样液（BioTechniques，9:558，1990）。普通 DNA 上样液不含变性剂，也没经过去 RNase 处理，所以不要使用。 尤其需要注意的是不要使用 TBE 进行 RNA 电泳，因为 TBE 所含硼酸 是研究多糖的经典方法----硼酸络合法中的关键成分，硼酸通过与 RNA 核糖中的羟基发生络合反应，形成 RNA 分子内或 RNA 分子间的络合复 合物，使同样长度的RNA 具有不同的泳动速度，电泳条带弥散，同时有 大的 RNA 络合复合物迟留在加样孔中（一般会误以为是基因组 DNA 污 染）。RNA 分子内或RNA 分子间的络合物的形成的多少和比例又与硼酸 与 RNA 的数量比例有关，而 RNA 样品中污染的其他多糖也会参与此反 应，使硼酸对 RNA电泳的影响更复杂，所以 TBE 对 RNA 电泳的影响 没有规律性和重复性。有的样品可以使用有的又不行，是避免使用。

16. RNA 产量产率测定：
将 5-10 μL RNA 溶于 TE 缓冲液中(pH7.5-8.2 之间)检测其在 OD260的光吸收。通过光吸收可以得出 RNA 浓度（1 OD260 的 RNA=40，μg/mL），进而计算出 RNA 的产量（浓度 X 体积)和产率(RNA 产量/细菌用量)。注意不要将 RNA 稀释在 DEPC 水中检测 OD260 和 OD280，否则光吸收比在 TE 中测得的低 10%-15%。

17. RNA 纯度测定：无污染的总 RNA 的 OD260/OD280 一般在 1.8-2.1 之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，OD260/OD230 一般在2.0-2.3 之间，如果低于或高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质或多糖的污染，但一般不影响 RT-PCR 等反应。蛋白质污染可以通过酚/氯仿抽提一次然后酒精沉淀去除，DNA 和多糖污染可以分别用基因的 DNA Erasol 和 PS Erasol 去除。测 OD 时 RNA 不能过度稀释使 OD 读数低于仪器的有效范围。