一步式染料法qRT-PCR试剂盒

一步式染料法qRT-PCR试剂盒

产品及特点 本产品是基于荧光染料检测的即用型 RT-PCR 试剂盒，可以对靶 RNA 分子进行实时定量 RT-PCR 分析（quantitative RT-PCR、qRT-PCR）。产品含有经过优化的缓冲液组分、逆转 录酶、热启动 Taq DNA 聚合酶、Taq DNA 稳定剂、dNTPs、MgCl2和稳定剂等所有实时定 量 RT-PCR 所需要的成分，用户只需加入 RNA 模板和引物即可进行染料法实时定量 RT-PCR 反应，具有广泛的用途。

本产品具有下列特点： 1. 以 2×Mix 提供，用户只需准备模板、引物和 ROX 染料（取决于 qPCR 仪器）即可以进 行染料法实时定量 RT-PCR 实验，非常方便快捷，降低了操作误差。 2. 各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。灵敏度最高时可以达 到 50 拷贝/反应（跟模板质量，引物设计等相关）。 3. 灵敏度和专一性比常规 RT-PCR 更高。 4. 可用于基因表达分析、SNP 分析、拷贝数分析等实验。也可以用于定性检测。 5. 本产品只能用于科研，1mL 足够 100 次 20uL 体系的染料法 qRT-PCR 反应。 规格及成分 成 份 编 号 塑料袋包装 2×染料法 qRT-PCR 缓冲液 190102a 500 uL（橙色盖） 10×染料法 qRT-PCR 酶混合液 190102b 100 uL（红色盖） 使用手册 190102sc 1 份 

运输及保存 低温运输，-20℃保存, 不冻融时保存期限为 12 个月。如果需要每天使用，可在 4℃放置三周。 

自备试剂 RNA 模板、引物、超纯水。

使用方法 1. 如果有 N 个样品并且做定量分析，设置 N+7 个反应，多出的 7 个中，6 个是做标准 曲线的阳性对照，一个是阴性对照（NC）。在 N+7 个 PCR 管中，加入下列成分。如果是 做定性分析，则 6 个做标准曲线的样品缩减成一个阳性对照（PC），用户自己需要根据下 表进行适当修改（把 6 个标曲反应改成 1 个阳性对照反应）。 成分 N 个 样品管 6 个标准 曲线管 NC 管 2×染料法 qRT-PCR 缓冲液 各 10 uL 各 10 uL 10 uL 自备引物 1（10uM） 各 1 uL 各 1 uL 1 uL 自备引物 2（10uM） 各 1 uL 各 1 uL 1 uL N 个自备模板 RNA 各 1-2 uL 不加 不加 自备阳性对照模板（6 个梯度） 不加 各 1 uL（1 管 加 1 个梯度） 不加 阴性对照模板（水） 不加 不加 1 uL 自备 50×ROX I 染料 或 自备 50×ROX II 染料（见注） 各 0.4 uL 各 0.4 uL 0.4 uL 10×染料法 qRT-PCR 酶混合液 2 uL 2 uL 2 uL 补超纯水到 20 uL 20 uL 20 uL 注，下列信息仅供参考，具体以 qPCR 仪器的使用手册为准。 1、不需要 ROX 的机型：Agilent MX3000 和 MX4000、iCycler IQ、LightCycler 480、，、 Smart Cycler System、Thermal Cycler Dice Real Time System 等型号的荧光 PCR 仪器 不需要加 ROX 染料，但加入的话也不会影响整个 PCR 分析。 2、需要使用 ROX I 的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step One、Step One Plus。 3、需要使用 ROX II 的机型：ABI Prism7500、7500 Fast、MJ Opticon、MJ Chromo4、 Corbett RotorGene 3000。 

2. 放入荧光 PCR 仪中进行扩增, 下表的扩增参数仅供参考，一定需要根据靶分子长度，引物 的 Tm 值等进行调节。一般选择三步法 PCR： 步骤 反应参数 备注 逆转录（RT 步骤） 94℃ 30 分钟 预变性 94℃ 2 分钟 PCR（35-45 次循环） 94℃ 15 秒 55-65℃ 15-30 秒 在此步采集 FAM 通道的 荧光信号 72℃ 30 秒 如果引物 Tm 值接近 60℃，也可以选择两步法 PCR： 步骤 反应参数 备注 逆转录（RT 步骤） 94℃ 30 分钟 预变性 94℃ 2 分钟 PCR（35-45 次循环） 94℃ 15 秒 60℃ 30-60 秒 在此步采集 FAM 通道的 荧光信号 

3. 数据处理 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘 制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算 出其浓度。 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性。一般情况下，阴性对照 Ct 大于或等 于 40（阈值需要以阴性对照的 Ct 值确定，此处为便于叙述以 40 为例，具体情况很可能 阈值不一样）。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。 对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40， 则为阳性。 

关联产品 染料法 qPCR MagicMix