柱式病毒RNA提取试剂盒
柱式病毒RNAout
产品及特点
本产品是在天泽基因一管式病毒 RNAOUT 的基础上开发的、专门用于从血清(血浆)等液体样品中提取微量病毒 RNA 的产品，它具有下列特点： 1. 操作简单，整个过程只需要 20 分钟左右，不需要额外在洗柱液中补加乙醇。 2. 灵敏度高，通过 RT-PCR 检测到的最终灵敏度可以达到 50 拷贝/mL。 3. 安全无毒，不需要使用苯酚和氯仿等有机溶液。 4. 如果加上病毒离心富集步骤，最多可以处理 1.5 mL 液体病毒样品。 5. 与 RT-PCR 和荧光 RT-PCR 兼容。 6. 价廉物美，性价比远低于国外同类产品。 7. 适用于各种材料，包括血清、血浆、脑脊液、尿液、粪便、培养细胞上清液等无细胞材料。
规格及成分
成份 编号 大纸盒包装 RNA 病毒裂解液 3073a 30 mL 上柱结合液 190602 40 mL 离心吸附柱 60911 50 套通用洗柱液 60408 50 mL RNA 洗脱液 71207 10 mL 使用手册 71001sc 1 份
运输及保存
常温运输和保存，RNA 病毒裂解液长期（1 周）放置需放 4℃，有效期一年。
自备试剂
无
使用方法
如果有 N 个样品，标记 N+2 个 1.5-2 mL 螺旋盖塑料离心管(如 Sarstedt CAT#:782.694.006)，多出的一个为阳性对照，一个为阴性对照。为避免污染，建议不要使用压盖式塑料离心管。在每个管上做个标记，以在后续操作时区别向心面和离心面。然后各加入 0.2 mL 液体样品（血清、血浆、尿液、脑脊液、唾液、眼泪等等）。 1.1、 如果是口腔拭子、咽喉拭子等各种拭子样品，则将拭子放入 0.2mL 自备生理盐水中挤压出液体，然后取 0.2mL 进行提取。 1.2、 如果是粪便等半固定样品，则取约 0.3mL 的样品，加入 0,3 自备生理盐水，震荡重悬，离心取 0.2mL 上清进行提取。 1.3、 如果血液，细胞培养液等含细胞的液体，可以离心用上清，也可以直接取用，但后者提取的 RNA 中有细胞的基因组 DNA 污染。血浆的抗凝剂必须是 EDTA 或 ACD，不能是肝素。使用 ACD 时由于所加入 ACD 会增加体积，样品会被稀释，得到的病毒滴度会比使用 EDTA 低 15%左右。血浆按 0.6mL/ 管的量分装保存，以避免反复冻融。 1.4、 如果样品是实体组织或培养细胞，则需要在自备生理盐水中匀浆后离心，用 0.2mL 上清液（含病毒）进行提取，但此种情况下最后得到的 RNA 不可避免的会含有基因组 DNA 污染。 1.5、 如果液体样品中的病毒需要富集，可以使用 1.5 mL 上述方法得到的液体在 4℃ 24,000 g 冷冻离心 60 分钟, 移弃 1.3 mL、用剩下的 0.2mL 继续操作。 2. 加入 0.6 mL RNA 病毒裂解液，振荡 30 秒混匀后室温放置 10 分钟。注意：RNA 病毒裂解液在 4℃放置后可能会产生沉淀，使用前必须放在 65℃水浴使沉淀彻底溶解并充分摇匀后再取用。 3. 加入 0.8mL 上柱结合液到离心管中，颠倒混匀后转移一半的混合液（0.8 mL）到离心吸附柱中，室温放置 2 分钟。 4. 12,000 rpm 室温离心 1 分钟，弃收集管中的穿透液，把离心吸附柱放回到收集管中。 5. 将剩余的另外一半裂解液（0.8mL）转移到离心吸附柱中，室温放置 2 分钟。 6. 12,000 rpm 室温离心 1 分钟，弃收集管中的穿透液，把离心吸附柱放回到收集管中。 7. 加入 0.7 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，12,000 rmp 室温离心 1 分钟，弃收集管中的穿透液，把离心吸附柱放回到收集管中。 8. 加入 0.3 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，12,000 rmp 室温离心 1 分钟，弃收集管中的穿透液，把离心吸附柱放回到收集管中。此为第二次洗涤，可以跳过。 9. 12000 g 室温离心半分钟。 10. 在离心吸附柱的滤膜的中部加入 30-100 uL RNA 洗脱液，然后将离心吸附柱套入一新的 1.5 mL 离心管中，室温放置 2 分钟。 11. 12000 g 室温离心 1 分钟，离心管中收集的样品即为 RNA。 12. RNA 样品可以直接用于 RT-PCR 或逆转录反应，也可放-80℃长期保存。注：病毒提取的核酸量远不足以电泳检测，提取后可通过 RT-PCR 检测，最终灵敏度可以达到 50 拷贝/mL。
相关资料
常见人类疾病相关 RNA 病毒病毒 疾病名称 类型 长度(Kb) Measles virus measles ssRNA 4.5~85 Hepatitis A Virus hepatitis type A ssRNA 7.5 Poliomyelitis virus polio ssRNA 7.8 Rubella virus German measles ssRNA 7.9 Hepatitis C Virus hepatitis type C ssRNA 9.3~9.4 Human immunodeficien cy virus AIDS ssRNA 9.7 Dengue Virus dengue ssRNA 11 Yellow fever virus yellow fever . ssRNA 11 Rabies virus rabies ssRNA 11.9 Influenza A virus influenza ssRNA 13.5 Mumps virus mumps ssRNA 15.4 Ebola virus virus hemorrhagic fever ssRNA 19
疑难解答
Q：提取液体样品/病毒核酸(RNA 或 DNA)为何很难？ A：原因一是量少。病毒颗粒中的 RNA 或 DNA 是作为遗传物质保存，每个病毒最多只携带几个拷贝(而一个细胞中有上万种 RNA 分子，每种 RNA 有很多拷贝)，同时其长度也十分有限(一般不到细胞基因组的万分之一)，样品中病毒数往往又不是很多，使得样品中病毒核酸的绝对量往往比一个细胞中核酸的绝对量还少，所以操作中十分容易丢失。另外，由于得到的核酸绝对量很少，不能使用电泳和测 OD 检测，只能通过 PCR 或 RT-PCR 检测，而 PCR 或 RT-PCR 的条件又需要优化，所以要确定提取是否成功十分不容易。
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