Western及IP细胞裂解液

名称 Western及IP細胞裂解液 Cell Lysis Buffer for Western and IP

货号 100ml

存储 -20℃保存，12个月有效。

试剂组分 

Western 及 IP 细胞裂解液----100mL----Store at -20℃

PMSF(100mM)----1.5mL----Store at -20℃（附送）

产品简介 

Western及IP细胞裂解液(Cell lysis buffer for Western and IP)，是一种在非变性条件下裂解细胞的裂解液。本细胞裂解液裂解的细胞，可以用于PAGE，Western，免疫沉淀(immunol precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)。

Western及IP细胞裂解液的主要成分为20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，低浓度sodium pyrophosphate等组成，并含有多种蛋白酶抑制剂成分，可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。用Western及IP细胞裂解液裂解得到的蛋白样品，可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的Triton X-100等干扰物质，不能用Bradford法测定由本裂解液裂解得到样品的蛋白浓度。

使用说明 

对于培养细胞样品：

(一)贴壁培养细胞

1、 取 Western 及 IP 细胞裂解液置于室温溶解混匀，加入 PMSF，使 PMSF 终浓度为 1mM。[根据使用量，比如取每1ml RIPA 加入10ul PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM，混匀备用 （PMSF现用现加）。]

2、 去除贴壁细胞的培养液，用 PBS、 NS 或无血清培养液清洗 1 次，低速离心，弃上清，留取沉淀。

3、 按照 6 孔板每孔加入 100～200μl 含有 PMSF 的裂解液的比例，加入 Western 及 IP 细胞裂解液。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液作用于细胞 1～5s内，细胞就会被裂解。

4、 10000～12000g，离心 3～5min(如果用冷冻离心机 4℃离心效果更佳)，取上清。

5、 进行后续的 SDS-PAGE、 Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

 裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入100微升裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到150微升或200微升。

(二)对于悬浮培养细胞：

1、 取 Western 及 IP 细胞裂解液置于室温溶解混匀，加入 PMSF，使 PMSF 终浓度为 1mM。

2、 低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。

3、 用手指轻弹细胞，使其松散。按照 6 孔板每孔细胞加入 100～200μl 含有 PMSF 的裂解液的比例，加入 Western 及 IP 细胞裂解液。通常 6 孔板每孔细胞加入 100μl 裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到 150～200μl，再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。

4、 10000～12000g，4℃离心 3～5min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。

5、 进行后续的 PAGE、 Western、免疫沉淀等操作。

(三)组织样本

1、 取 Western 及 IP 细胞裂解液置于室温溶解混匀，加入 PMSF，使 PMSF 终浓度为 1mM。

2、 把组织剪切成细小的碎片，越小越好。

3、 取在液氮或超低温冰箱中冷冻 30min 以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在 1～2min 之内，以减少蛋白的降解。

4、 按照每 20mg 组织加入 100～200μl 裂解液的比例，加入含有 PMSF 的裂解液。冰上或 4℃裂解 30～60min。

5、 步骤 3、 4 亦可以采用如下过程：按照每 20mg 组织加入 100～200μl 裂解液的比例加入含有 PMSF 的 Western 及 IP 细胞裂解液。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，过程尽量控制在 1～2min 之内，以减少蛋白的降解。

6、 按照每 20mg 组织加入 100～200μl 裂解液的比例，加入含有 PMSF 的裂解液。

7、 10000～12000g，4℃离心 10～15min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。

8、 进行后续的 PAGE、 Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

 注意事项 

1、 去除贴壁细胞的培养液时，如果血清中的蛋白没有干扰，可以不用清洗。

2、 如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。

3、 如果细胞量较多，必需分装成 50～100 万细胞/离心管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。

4、 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈 Vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。

5、 溶解Cell lysis buffer for Western and IP 时，应尽量缩短溶解时间，避免裂解液中的有效成分失效。

6、 细胞裂解的操作步骤，应置于冰上或 4℃进行。

附言建议 

用于普通的Western、IP或co-IP，我们推荐使用Western及IP细胞裂解液，该裂解液已被国内各大研究机构广泛使用，用户普遍反映很好。裂解细胞或组织后，没有非常粘滞的透明状DNA团块形成，不必采用超声处理等就可以非常理想地用于后续操作。 另外该裂解液裂解的产物也适合用于磷酸化蛋白的Western检测。

对于某些特殊蛋白的IP，如果发现Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想，可以尝试用RIPA裂解液(强、中或弱)或NP-40裂解液。如果发现IP的时候背景很高，即非特异的蛋白也被IP下来，则需要选用裂解强度较高的裂解液，例如RIPA裂解液(强或中)。如果发现目的蛋白无法被IP下来，则说明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。

对于某些难溶解蛋白的Western，如果发现Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想，可以尝试使用裂解强度更高的裂解液例如RIPA裂解液(强、中)或SDS裂解液。

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