动物/细胞基因组DNA提取试剂盒

动物/细胞基因组DNA提取试剂盒（目录号：RTG2402）

● 试剂盒内容及保存：

● 储存条件和效期：

本试剂盒在室温（25℃左右）干燥条件下，可保存1年；更长时间的保存可置于2–8℃。2–8℃保存条件下，若溶液产生沉淀，应在使用前置于37℃下溶解沉淀至溶液澄清后再使用。单独包装的蛋白酶K和RNaseA收到后按照需要分装成小管，-20℃保存。

● 产品简介：

本试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，能提取多种细胞/组织中的基因组DNA。离心吸附柱可以高效、专一吸附DNA，可限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。

使用本试剂盒回收的DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。

● 提取得率：

● 准备工作：

1. 准备55℃和70℃水浴；无水乙醇；1.5ml灭菌离心管。

2. 按照标签所示在去蛋白液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，混匀后盖紧瓶盖后室温贮存备用。

3. 每次使用前请检查缓冲液GA，缓冲液GB和去蛋白液GD是否有沉淀生成，如果出现沉淀，37℃温浴至沉淀溶解后再使用。

● 操作步骤：

如非指出，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1. 处理材料：

a. 培养细胞：贴壁培养的细胞应先处理为细胞悬液（如用PBS缓冲液或类似缓冲液），10,000 g离心1分钟，倒尽上清，加入200 μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。

b. 组织：取约30mg动物组织（脾组织用量应少于10 mg）加入到事先盛有200μl 缓冲液GA的1.5ml离心管中，用研磨杵彻底将组织研碎。

2. 加入20 μl蛋白酶K (20 mg/ml)溶液。

a. 提取细胞基因组时，加入蛋白酶K混匀后，55℃放置5-10分钟。

b. 提取组织基因组时，加入蛋白酶K混匀后，在55℃放置，直至组织溶解。

注：不同组织裂解时间不同，通常需1-3小时即可完成（鼠尾需要消化过夜）,期间间歇颠倒混匀样品。

3. 加入10 μl RNaseA（10 mg/ml）溶液，混匀后室温放置2分钟。

4. 加入220 μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

注：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置一段时间后会消失。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，会影响DNA的纯度和得率，而且可能导致步骤6中离心柱堵塞。

5．加入220 μl 无水乙醇，颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

注：加入乙醇后会产生絮状沉淀，可用枪头反复抽打1-2次将沉淀弄碎后再上柱。如果絮状物未做处理，容易导致步骤6中离心柱的堵塞。

6．将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CG中（吸附柱放入收集管中），11,000g离心2分钟，倒掉废液，吸附柱CG放回收集管中。

注：如果出现吸附柱堵塞现象，可将离心时间延长到5分钟。

7．向吸附柱CG中加入500 μl去蛋白液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），11,000g离心1分钟，倒掉废液，吸附柱CG放入收集管中。

8．向吸附柱CG中加入700 μl 漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），11,000g离心1分钟，倒掉废液，吸附柱CG放入收集管中。

9．向吸附柱CG中加入500 μl 漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），11,000g离心1分钟，倒掉废液。

10．将吸附柱CG放回废液收集管中，11,000g离心2分钟。

注：此步骤非常重要，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。

11．将吸附柱CG转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100 μl经70℃水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，11,000g离心2分钟。

注；1. 洗脱缓冲液体积不少于100 μl，体积过小影响回收效率。

2. 洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。

12. DNA产物-20℃保存。