MTT细胞增殖-毒性检测(MTT Assay)试剂盒

描述：MTT四唑蓝是一种能接受氢原子的染料，可直接加入到细胞培养基中，被活细胞的线粒体琥珀酸脱氢酶还原为水不溶性的深紫色结晶状产物formazan，但死细胞不能进行此还原反应。用特定溶剂可溶解MTT所产生的水不溶性紫色结晶，然后用酶标仪在570 nm波长附近(500~600 nm)处测定光吸收值，可反映活细胞的数量和代谢活力，并由此反映细胞的存活、增殖、生长、和毒性。例如加入细胞生长因子后，增殖生长旺盛的细胞将还原更多的MTT，并具有较高的光吸收度；反之，抗增殖抗肿瘤或细胞毒药物处理后细胞生长越慢或毒性越大，则光吸收度越低。也用于检测非药物刺激如物理因素对细胞增殖和活力的影响。与3H-胸腺嘧啶掺入方法相比，简便快速可靠，不使用放射性同位素，广泛用于检测细胞存活、增殖、生长、毒性实验(1)。

组成与储存： (500 assay)
1. MTT Stock: 5 ml，−20ºC 12个月
2. MTT 溶解剂: 50 ml, 室温保存。

使用方法：
1. 使用与酶标仪匹配的96孔培养板。测定细胞增殖每孔加100微升2000个细胞，测定细胞毒性每孔加100微升5000个细胞。应根据所用的细胞类型、增殖速度进行调整。注意设置3个重复孔和无细胞培养基对照。37 ºC培养细胞至合适的时间，然后给予特定的药物或物理因素刺激。
2. 药物处理结束后，每孔每100 µl培养基加入10µl MTT Stock，37 ºC培养箱内继续孵育4小时。也可在换100 µl新鲜无血清培养基后再加入MTT Stock。 
3. (a) 如果细胞贴壁良好，可吸除培养基，然后每孔加入100µl MTT 溶解剂，此时应注意保持各孔内液体容积一致。
(b) 如果细胞贴壁不佳吸除培养基会导致MTT生成的结晶丢失，则直接在孔内加入100µl MTT溶解剂，注意此时测试孔和对照空内原有的液体积应并保持一致。37 ºC培养箱内继续孵育4小时。显微镜观察紫色结晶状formazan沉积物应全部溶解，这通常需要2~4 h但随细胞类型、数量、活力变化。如未完全溶解应延长孵育时间。显微镜观察一旦结晶溶解完毕应尽快测定OD吸光度值。
4. 在570nm测定OD吸光度并进行比较计算。如无570nm滤光片可用500-600nm范围内的滤光片。注意：为准确考虑可在699 nm处测定未还原的MTT本身的吸光度OD值， 然后用OD570减去OD699。这在进行3(b)操作时尤为必要。

说明：
1. 在进行培养或检测反应时应观察培养基是否蒸发减少。可用封口膜部分封闭培养板。
2. 微生物污染将导致测定结果不准确。另外，如果MTT Stock由黄色变灰绿色应弃去。MTT Stock预先稀释于培养基中配制成工作液，通常在4ºC一周内稳定。
3. 可在非96孔板进行MTT Assay，需要成比例加大反应体系。反应后用比色杯测定OD。 
4. 浓度高于10%血清将降低灵敏度。使用不含酚红的培养基将使灵敏度提高约20%。