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凋亡因子CASPASE系列检测

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北京 更新日期：2024-12-08

北京嘉美臻元生物技术有限公司

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产品详情:

中文名称：
凋亡因子CASPASE系列检测
产品类别：
技术服务 免疫生化实验

凋亡因子Caspase系列检测


 

一、Caspase 家族及其在细胞凋亡中的作用
Caspase全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase)，是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白酶，与真核细胞凋亡密切相关，并参与细胞的生长、分化与凋亡调节。Caspase是一类蛋白酶家族，根据其蛋白酶序列的同源性可分为3个亚族：Caspase-1亚族包括 Caspase-1、4、5、11；Caspase-2亚族包括Caspase-2、9； Caspase-3亚族包括Caspase-3、6、7、8、10。起细胞凋亡执行作用的是caspase-3、6、7。Caspase又分为起始者（initiators）和执行者（executioners）两类，起始Caspase在外来蛋白信号的作用下被切割激活，激活的起始Caspase对执行者Caspase进行切割并使之激活，被激活的执行者Caspase通过对caspase靶蛋白的水解，导致程序性细胞死亡。
 
1、凋亡起始者：Caspase 9、8、2、10、11；同性活化——切割自身前体
 
2、凋亡执行者：Caspase 3、6、7；异性活化——切割结构蛋白、功能蛋白
 

二、Caspase的检测
嘉美实验有多年的检测caspase系列酶的经验。下面以检测caspase-3酶活性为例，介绍caspase的检测。

1、检测原理
半胱氨酸蛋白酶caspase家族蛋白的激活是凋亡进程中的一个必要的决定性事件。其中caspase-3的激活在凋亡信号传导的许多途径中发挥着关键的作用。Caspase-3正常以酶原（32KDa）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KDa）和两个小亚基（12KDa）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。活化的Caspase-3可以剪切特定的氨基酸序列。嘉美实验用具有高度特异性Caspase-3荧光底物用来检测Caspase-3 活性。在Caspase的底物多肽(如Caspase-3的底物为DEVD)上标记pNA  (p-nitroanilide, 对硝基苯胺).当活化的Caspase剪切标记的底物多肽后, pNA被释放出来,此时游离的pNA的发射光谱可用分光光度计或酶标仪在400或405nm 检测,进而推知Caspases的活性.


2、实验前准备
消毒的EP管、枪头、三蒸水、冰、水浴箱、实验组及对照组心肌组织、超速低温离心机、酶标仪、721分光光度计

3、活性测定操作步骤
  1）每组试剂组成 

共需 2×Reaction buffer 810 ul，配制2×830ul以防不够，用前加入8.3ul DTT
活性表示为＝样本OD1－背景OD1（实验组）/样本OD2－背景OD2（对照组）
 
  2）操作步骤
   （1）从低温冰箱中取出用锡铂纸包着的组织（已称重标记好的），取2-3块（30mg/块），放在EP管中，一直浸在冰水中。
   （2）锡铂纸剥去，组织直接置于EP管中，加裂解buffer（溶后4摄氏度保存）约700ul；冰上EP管中，用小弯剪将心脏组织剪碎，越碎越好；组织、裂解buffer比例：1：10；冰上操作。
   （3）开匀浆机：取几块冰块于小烧杯中，接自来水成冰水液；将EP管置于盛有冰水的小烧杯中，固定于匀浆机上；先做对照组；将转头插于组织液面下，打开电源，逐渐调大速度至max，上下搅动，直至浑浊，基本无小的组织块为止；调小速度至零，关电源，取出转头，EP管放回冰水底座
用蒸馏水冲洗转头，液冲至废烧杯中；依次以同样方法将样本组进行匀浆。注意：放空转，慢慢加速，别转别上下移动轴。
   （4）匀浆后置于离心机内：先设时间10min，“起动”；缓慢增大离心速度至1000×10r/min；缓慢减小离心速度，降至30×10r/min时，“停机”灯亮，即可取出；注配平：套管A、B、C、D配平。
   （5）取Reaction buffer 6ml，用前加入60ul DTT（稀释100倍）；吸取上清至小EP管；依次加Reaction buffer、上清、底物至ELISA板，加底物时，每加一次换一个枪头（因为要混匀）；注：底物每取完一次都要盖盖，避光； 加完底物后，混匀。
   （6）水浴箱中孵育90min。
   （7）预热酶标仪30min（提前半小时打开酶标仪）。
   （8）酶标仪上读取OD值（405nm处测）。
 
  3）测蛋白
   （1）需准备考马斯亮兰试剂盒
   （2）用剩余的血清测蛋白
   （3）样本管：每管2.1ml考马斯亮兰＋35ul血清   （考马斯亮兰原液5ul，5倍稀释）；空白管：2.1ml考马斯亮兰。
   （4）开盖调零，关盖调百，595nm处测定

  4）注意事项
   （1）提前计算所需Reaction buffer的量，然后用前加入DTT（稀释100倍）。
   （2）DEVD-pNA要避光保存。
 
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公司简介

北京嘉美臻元生物技术有限公司（嘉美实验）是一家专注于生命科学领域的高科技企业，公司创立于2005年，由在国内科研试剂、实验技术、质量管理领域有着十几年从业经验的专业、专家团队组建而成；2009年在北京重组，先后成立了北京嘉美诺斯生物科技有限公司（主要开展生物相关产品进、出口业务），北京嘉美纽诺生物科技有限公司（主要为大型药厂、诊断试剂公司提供服务）。为方便实验服务项目开展，成立了北京嘉美臻元生物技术有限公司，以“嘉美实验”品牌提供实验外包服务。近五年来，公司已为全国各类科研用户提供了近5000个大大小小的专项实验外包或整体课题外包项目服务，实验项目涵盖了生命科学、医学的各研究领域。经过多年努力，公司已成为

成立日期 (10年)
注册资本 100.000000万人民币
员工人数 50-100人
年营业额 ￥ 100万-300万
经营模式 服务
主营行业 生化试剂,细胞培养,微生物学,细胞生物学,免疫安全

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