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明胶酶谱MMP(2/9)

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北京 更新日期：2024-04-11

北京嘉美臻元生物技术有限公司

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产品详情:

中文名称：
明胶酶谱MMP(2/9)
产品类别：
技术服务 免疫生化实验

明胶酶谱MMP(2/9)

一、实验原理
MMP酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1％明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的 MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与 MMP-2和MMP-9活性成正比。
 
复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（是放在摇床上摇，30min／次，做2次或15min/次，4次。静置于Trition中是不妥的。）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs恢复了活性。
 
二、实验步骤
1、取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。
2、次日收集上清液，将上清液移入离心管中 2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。
3、根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。与5×上样缓冲液混合，13ul样本+4ul上样缓冲液。（不要用枪用力吹打，防止出现过多气泡）
4、配制分离胶和浓缩胶，16ul/孔上样（根据表达强度和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE 电泳100v约1.5小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直）。
5、电泳结束后，将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，pH7. 6) 中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次，每次20分钟，接着，将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃ 孵育42h。
6、孵育结束后经染色液(0.05% Coomassic 亮蓝、30%甲醇、10%乙酸) 染色3h，及脱色液A、B、C(甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5%) 分别脱色0.5、1、2h后，显示出MMP-2（72KD） 和MMP -9（92 KD）为位于蓝色背景上的透亮带，用凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，做统计分析。
 
三、注意事项
1、制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡 。
2、明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和PH值等因素的影响，因此缓冲液 配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。
3、用大梳子。
4、孵育液的PH在7.5-7.6，复性的TRITON时间长了会有絮状物，所以实验时尽量使用新鲜配置的。
5、孵育的37度不要在CO2培养箱中，因为会改变孵育液的PH值，在普通孵箱即可。
6、明胶要4度保存，配好后1周内使用。
 
四、凝胶制备
1、玻璃板对齐后放入夹中，垂直卡紧，加满水检漏。
2、配10%分离胶，APS和TEMED作用为促凝，最后灌胶前加。若板不漏水，则将水倒出，并用吸水纸洗净后灌胶，灌至大约3/4处，上面加满水压平。
3、配浓缩胶，同样地，APS和TEMED最后加，分离胶灌入约30min后观察小烧杯中剩余分离胶是否已凝，同时仔细观察可见玻板水和胶间有一条折线，说明胶已凝固。
4、将上面的水倒去，吸水纸洗净，灌入浓缩胶，灌满，注意一定不要有气泡，然后将梳子插入，注意保持水平，约30min后凝固可用。
5、拔梳子在电泳缓冲液中拔，加样孔用小针筒冲洗干净再上样，注意上样时勿使样品逸至邻孔，样品混匀时要轻，不要产生气泡，否则加样时易导致逸出而使结果不准确。
明胶酶谱MMP(2/9)_MMP酶谱法_免疫生化实验_

公司简介

北京嘉美臻元生物技术有限公司（嘉美实验）是一家专注于生命科学领域的高科技企业，公司创立于2005年，由在国内科研试剂、实验技术、质量管理领域有着十几年从业经验的专业、专家团队组建而成；2009年在北京重组，先后成立了北京嘉美诺斯生物科技有限公司（主要开展生物相关产品进、出口业务），北京嘉美纽诺生物科技有限公司（主要为大型药厂、诊断试剂公司提供服务）。为方便实验服务项目开展，成立了北京嘉美臻元生物技术有限公司，以“嘉美实验”品牌提供实验外包服务。近五年来，公司已为全国各类科研用户提供了近5000个大大小小的专项实验外包或整体课题外包项目服务，实验项目涵盖了生命科学、医学的各研究领域。经过多年努力，公司已成为

成立日期 (9年)
注册资本 100.000000万人民币
员工人数 50-100人
年营业额 ￥ 100万-300万
经营模式 服务
主营行业 生化试剂,细胞培养,微生物学,细胞生物学,免疫安全

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