一步法microRNA反转录试剂盒

由于miRNA(microRNA)分子序列较小，仅20nt左右，没有真核生物特有的Poly(A)尾巴结构，采用传统Oligo dT引物和随机引物很难获得从miRNA到cDNA的反转录产物。目前普遍采用的解决方案有两种：特异性反转录引物（下图A所示）、两步加A法反转录方案（下图B所示）。Biorab公司开发出一套全新的一步法miRNA反转录试剂盒，可以对成熟的miRNA同时完成Poly(A)反应和反转录反应，直接获得含有特异性tag和15(T)的cDNA产物（下图C所示）。该方法使得miRNA反转录与mRNA的反转录一样轻松,直接将提取的microRNA与反应缓冲液混合物混合并置于PCR仪上1小时即可获得高浓度的、包含所有miRNA分子的cDNA产物,获得的cDNA产物适合于采用SYBR Green染料法进行RealTime PCR进行定量检测。



产品组成：

储存：请置于-20℃，可保存2年，避免反复冻融。
注：如4×One step miRNA RT Solution出现沉淀属正常现象，可用手捂化，混合均匀后使用不影响实验结果。

特别说明： 10×miRNA RT Primer 引物为5'-CAGGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'，定量扩增用特异性上下游引物进行扩增，下图2是以 hsa-miR-21 为实例说明特异性上下游引物的设计方法（Biorab的microRNA 荧光定量 PCR 试剂盒提供所有 miRNA 检测，货号：MTAXXXXX，所有引物均经过设计优化，详细请于引物列表中查询。如果您研究的miRNA分子不在列表中，请来信咨询，我们将及时给您优化设计）。

图1：技术原理图：


图2：hsa-miR-21实例设计原理：


操作方法：

1．按以下组分配制反转录反应液：

2. 在PCR 仪上按以下条件进行反应：
  37℃——————60min
  95℃——————5分钟
3．获得 cDNA 产物后使用microRNA 荧光定量 PCR 试剂盒进行 miRNA 定量检测。使用该试剂盒反转录所得 cDNA 产物包含了样品中所有miRNA 反转录产物，可用于多个基因的检测分析，可使用内参基因进行定量矫正。内参基因可选择使用RNU6B miRNA 荧光定量 PCR 试剂盒(货号：MTA01501)，适用于来源于人和鼠等哺乳动物的样品；RNU44 miRNA 荧光定量 PCR 试剂盒(货号：MTA01502)、 RNU48 miRNA 荧光定量 PCR 试剂盒(货号：MTA01503)，适用于来源于人的样品；SnoRNA135 miRNA 荧光定量 PCR 试剂盒(货号：MTA01504) 、SnoRNA202 miRNA 荧光定量 PCR 试剂盒(货号：MTA01505)适用于来源于鼠的样品。Biorab 提供的内参扩增引物浓度均为 10μM，每 20μl 反应体系中加入0.4-0.8μl。
根据机型选择步骤A或B，配制反应体系：
步骤A: 需要添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的Real-Time PCR 仪，包括：ABI PRISM7000/7700/7900HT,7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR（Applied Biosystems)；Mx3000P（Stratagene)等。按照如下组分配制 20μl PCR 反应体系：

注：引物初次使用请用0.4μl，视实验结果进行调整。
步骤B:无需添加 ROX 染料进行反应孔间信号矫正的Real-Time PCR 仪，包括：LightCycler（Roche Diagnostics)；MiniOpticon、Opticon2、MyiQ 2、CFX96 Real-Time PCR(Bio-Rad & MJ)；Line-Gene(Bioer，杭州博日)等。按照如下组分配制 20μl PCR 反应体系：

4．进行 Real-Time PCR 反应，通常采用两步法，程序如下：

注意：使用该方法通常可以准确检测到>0.01fM的microRNA 分子，过多的循环数会造成精确性降低。推荐的循环数为 30 个，在检测极低样品浓度时可将循环数调整到35 个。
5．扩增结果分析和数据处理：
反应结束后确认 Real-Time PCR的cDNA 样品和 NTC 阴性对照的扩增曲线和融解曲线。