鱼脾淋巴细胞

鱼脾淋巴细胞

采用免疫磁珠阳性分选从草鱼的脾淋巴细胞组织中分离获取细胞，经0.25%胰蛋白酶-EDTA传代后，采用特异性细胞培养体系维持培养；通过Transwell模型检测CD105表达，结合流式细胞术分析SSEA-1蛋白水平，并采用生物膜干涉技术(Biacore)进一步验证细胞生物学特性。

产品名称：鱼脾淋巴细胞

英文名称： Fish Splenic Lymphocytes

组织来源： 脾脏组织

默认种属 ：鱼

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的鱼脾淋巴细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的鱼脾淋巴细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 鱼脾淋巴细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 悬浮

细胞形态： 圆形

传代比例： -

传代特性： 不传代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

鱼脾淋巴细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 准备无菌手术器械（手术剪、镊子、眼科剪）、培养耗材，高压灭菌后备用；超净工作台紫外消毒。

2. 提前配制冰预冷E3培养液、消化液（胶原酶Ⅳ、透明质酸酶）、胰蛋白酶、RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 双抗 + 50μM β-ME（28.5℃预热）、双抗溶液。

3. 斑马鱼（成年），0.01% MS-222麻醉，所有试剂冰浴预冷备用。

二、取材与预处理

1. 冰浴麻醉后处死，碘伏消毒术野，无菌操作取出目标组织。

2. 浸入冰预冷E3培养液中冲洗干净，仔细分离去除血管、神经及结缔组织。

3. 将组织转移至新的培养皿中，用手术剪精细剪碎成细小碎块。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块加入胶原酶Ⅳ+透明质酸酶混合消化液，28.5℃消化32min，间断吹打。

2. 加入含10% FBS的培养基终止消化，吹打制备单细胞悬液。

3. 200g离心10min收集细胞沉淀，PBS重悬洗涤两遍。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液过200μm细胞滤网，采用Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞，去除团块和未消化组织。

2. 沉淀细胞用RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 双抗 + 50μM β-ME重悬，台盼蓝染色检测活力（应>90%），以60000.0-220000.0cells/cm²密度接种。

3. 放入28.5℃、非CO2培养箱恒温培养箱，每2天更换新鲜培养基，镜检观察悬浮或半贴壁生长，圆形或椭圆形，折光性强及生长状态。

取材前动物需禁食12小时，冰浴致死法处死后立即取淋巴组织，置于预冷的PBS中运输至实验室，从取材到开始消化处理不超过20分钟。

培养板需提前用0.01%多聚赖氨酸包被2小时，使用前PBS洗涤3次，未处理的培养表面会导致淋巴贴壁不良和形态异常。

该细胞属于贴壁依赖性细胞，体外增殖速度适中，建议每3天更换一次培养基，传代时按1:3比例操作，避免过度融合导致接触抑制。

培养基中必须含有RPMI-1640含10% FBS和1% P/S，其中重组生长因子需分装保存于-80°C避免反复冻融，每次使用新鲜稀释至工作浓度以保证实验可重复性。

培养过程中定期观察培养基pH变化(颜色由红变黄提示需换液)，换液频率根据细胞密度调整，高密度时每日换液一次，低密度时每2-3天换液。