猪心脏微血管内皮细胞

猪心脏微血管内皮细胞

以Duroc猪心脏微血管组织为材料，采用差速贴壁法分离内皮细胞，经胰蛋白酶-EDTA消化后传代，使用MEM基础培养基维持细胞生长；运用ATAC-seq检测Podocalyxin的细胞表面/胞内表达，通过免疫沉淀(IP)分析蛋白表达谱，并结合bulk RNA-seq探究相关信号通路。

产品名称：猪心脏微血管内皮细胞

英文名称： Porcine Cardiac Microvascular Endothelial Cells

组织来源： 心脏组织

默认种属 ：猪

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的猪心脏微血管内皮细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的猪心脏微血管内皮细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 猪心脏微血管内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

猪心脏微血管内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 手术器械（剪刀、镊子、止血钳）及培养耗材经121℃高压灭菌20min；超净台紫外照射30min。

2. 配制冰预冷Hanks液、Ⅳ型胶原酶+弹性蛋白酶混合消化液、DMEM/F12 + 20% FBS + 50μg/mL 肝素 + 1% 双抗、胎牛血清、双抗，全部冰浴预冷。

3. 健康巴马小型猪（15-20kg），氯胺酮联合阿托品肌注麻醉处理。

二、取材与预处理

1. 过量麻醉剂心脏采血后处死，体表酒精消毒，暴露目标组织器官。

2. 无菌条件下摘取心脏组织，冰预冷Hanks液漂洗去除血液及杂质，去除周围结缔组织和脂肪。

3. 眼科剪将组织剪碎至1mm³小块，转入离心管。

三、细胞分离与消化

1. 剪碎组织加入Ⅳ型胶原酶消化液，38.5℃水浴消化30min，期间每隔5-10min振荡吹打。

2. 用含血清培养基终止反应，经200目筛网过滤获取单细胞悬液。

3. 4℃、200g离心10min，弃上清，PBS洗涤两次，重悬细胞沉淀。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经40μm滤膜过滤，采用Percoll密度梯度离心纯化内皮细胞，去除大颗粒杂质。

2. 用DMEM/F12 + 20% FBS + 50μg/mL 肝素 + 1% 双抗重悬细胞沉淀，调整接种密度后接种至胶原预包被的培养器皿。

3. 38.5℃、5% CO2培养，每2-3天换液一次，定期倒置显微镜观察鹅卵石样铺路石状排列，贴壁生长，细胞边界清晰及生长情况。

动物取材须在无菌条件下进行，心脏组织获取后迅速转入含抗生素的Hanks液中转运，组织离体时间超过1小时将严重影响脏微血管内皮的分离效率和活力。

培养器皿提前用0.1mg/ml纤连蛋白包被过夜，4°C保存，使用前用PBS洗涤2次，该处理可显著促进脏微血管内皮的贴壁生长。

该细胞为贴壁型细胞，体外培养条件下可稳定增殖，建议每2-3天换液，传代比例1:3，培养温度严格控制在38.5°C。

培养基配方中GM299培养基含20% FBS、5ng/ml VEGF和10ng/ml FGF为必需组分，添加顺序和方式需严格按照SOP操作，错误的添加顺序可能导致生长因子失活或沉淀形成。

日常维护中需每日检查细胞形态和培养基颜色，出现浑浊或颜色异常应立即换液并排查污染，传代后24小时内避免换液以利于细胞贴附恢复。