猪脑微血管周细胞

方法简介  实验室分离的猪脑微血管周细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的猪脑微血管周细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 猪脑微血管周细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 周细胞样

传代比例： 1:3

传代特性： 可传5-8代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

猪脑微血管周细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：6-8月龄巴马小型猪，体重15-20kg，每只可获得2.0-4.0×10⁶个细胞，活力>88%

试剂：中性蛋白酶、胶原酶D、透明质酸酶、Hanks液、F12培养基

分离纯化步骤

取目标组织用无钙镁PBS洗涤3次，剔除脂肪和结缔组织后剪成小碎片，加入中性蛋白酶、胶原酶D、透明质酸酶、Hanks液消化30-60分钟

消化液经100目不锈钢滤网过滤，收集滤液，4℃、400g离心10分钟收集细胞沉淀

经Percoll不连续密度梯度离心（400g/400g，10分钟）分离纯化目标细胞层

原代培养要点

细胞重悬于完全培养基中，按3×10⁴密度接种，置于37℃、5% CO₂恒温培养箱

细胞生长速率适中，每5-7天传代一次，传代后活力保持良好

常见问题优化

细胞活力差：严格控制消化时间，除消化步骤外全程冰上操作，使用新鲜配制试剂

纯度不达标：优化密度梯度离心条件，延长免疫磁珠孵育时间，增加洗涤步骤

细胞贴壁率低：使用合适包被基质（胶原/纤维连接蛋白/多聚赖氨酸），优化接种密度

一、实验前准备

1. 准备无菌手术器械（手术剪、镊子、眼科剪）、培养耗材，高压灭菌后备用；超净工作台紫外消毒。

2. 提前配制冰预冷Hanks液、消化液（Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶）、DNA酶Ⅰ、Neurobasal Medium + B27 + 1% 双抗 + 2mM GlutaMAX（38.5℃预热）、双抗溶液。

3. 健康巴马小型猪（15-20kg），氯胺酮联合阿托品肌注麻醉，所有试剂冰浴预冷备用。

二、取材与预处理

1. 过量麻醉剂心脏采血后处死，碘伏消毒术野，无菌操作取出脑组织。

2. 浸入冰预冷Hanks液中冲洗干净，仔细分离去除血管、神经及结缔组织。

3. 将组织转移至新的培养皿中，用手术剪精细剪碎成细小碎块。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块加入Ⅳ型胶原酶+胰蛋白酶混合消化液，38.5℃消化39min，间断吹打。

2. 加入含10% FBS的培养基终止消化，吹打制备单细胞悬液。

3. 200g离心10min收集细胞沉淀，PBS重悬洗涤两遍。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液过40μm细胞滤网，采用适当纯化方法去除杂质细胞，去除团块和未消化组织。

2. 沉淀细胞用Neurobasal Medium + B27 + 1% 双抗 + 2mM GlutaMAX重悬，台盼蓝染色检测活力（应>90%），以60000.0-240000.0cells/cm²密度接种。

3. 放入38.5℃、5% CO2恒温培养箱，每3天换液一次，镜检观察多突起状，贴壁生长，可见神经突延伸及生长状态。