鸡心脏微血管内皮细胞

鸡心脏微血管内皮细胞

从白来航鸡的心脏微血管组织中分离纯化内皮细胞，采用密度梯度离心法获得高纯度细胞群体，在F-12培养基下扩增培养；运用CCK-8增殖实验检测CD34, CD31标志物表达，通过免疫电镜分析蛋白表达谱，并结合细胞因子分泌检测综合评价细胞表型特征。

产品名称：鸡心脏微血管内皮细胞

英文名称： Chicken Cardiac Microvascular Endothelial Cells

组织来源： 心脏组织

默认种属 ：鸡

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的鸡心脏微血管内皮细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的鸡心脏微血管内皮细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 鸡心脏微血管内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

鸡心脏微血管内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 手术剪、镊子、培养耗材高压灭菌；超净台紫外通风30min。

2. 配制灌洗液 冰预冷PBS液、消化液（Ⅳ型胶原酶+弹性蛋白酶）+透明质酸酶、DMEM/F12 + 20% FBS + 50μg/mL 肝素 + 1% 双抗、双抗。

3. SPF级鸡胚（EGK阶段鸡胚），42℃水浴灭活，冰浴预冷所有缓冲液。

二、取材与预处理

1. 无菌条件下取胚组织，75%酒精浸泡消毒体表，无菌操作下暴露并摘取心脏。

2. 置于冰预冷PBS液中反复漂洗，去除血污及附属组织，仔细剔除结缔组织。

3. 将纯化后的心脏组织用眼科剪尽量剪碎，尽量减小组织块大小以利消化。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块与Ⅳ型胶原酶+弹性蛋白酶+透明质酸酶混合酶液按1:3比例混合，39℃振荡消化44min。

2. 加入含20% FBS的培养基中和酶活性，反复吹打使组织充分分散。

3. 细胞悬液经40μm滤网过滤，2次200g×10min离心洗涤，收集细胞。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经40μm滤网过滤，采用Percoll密度梯度离心纯化内皮细胞，去除未消化组织块。

2. 用DMEM/F12 + 20% FBS + 50μg/mL 肝素 + 1% 双抗调整细胞浓度至140000.0cells/mL，接种于预涂胶原的培养皿中。

3. 置于39℃、5% CO2培养箱中培养，每2-3天换液一次，倒置显微镜下观察细胞贴壁及鹅卵石样铺路石状排列，贴壁生长，细胞边界清晰。

取材操作全程在超净台中进行，心脏组织取出后尽快去除血管和结缔组织，用含1% P/S的PBS清洗至组织变白，整个过程温度控制在4°C。

培养器皿提前用0.1mg/ml纤连蛋白包被过夜，4°C保存，使用前用PBS洗涤2次，该处理可显著促进脏微血管内皮的贴壁生长。

该细胞为贴壁生长型，体外可传代10-15次，建议每2天换液一次，传代比例控制在1:2以内以维持细胞正常形态和功能。

培养体系中必须补充GM299培养基含20% FBS、5ng/ml VEGF和10ng/ml FGF，生长因子浓度需严格按照方案配制，浓度过高可能导致细胞异常分化，浓度过低则细胞增殖受限。

换液操作全程注意无菌操作，使用经0.22μm滤膜过滤的新鲜培养基，加入后轻摇培养皿使培养基均匀分布，避免产生气泡影响细胞生长。