兔胎盘间充质干细胞

兔胎盘间充质干细胞

以日本大耳白兔胎盘间充质组织为材料，采用免疫磁珠分选结合流式分选分离干细胞，经0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后传代，使用RPMI-1640培养基维持细胞生长；利用克隆形成实验结合凋亡检测(Annexin V/PI)检测SSEA-1, Oct4标志物表达，通过Western blot分析蛋白表达谱，并采用qRT-PCR在mRNA水平验证目标基因表达。

产品名称：兔胎盘间充质干细胞

英文名称： Rabbit Placental Mesenchymal Stem Cells

组织来源： 胎盘组织

默认种属 ：兔

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的兔胎盘间充质干细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的兔胎盘间充质干细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 兔胎盘间充质干细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:3

传代特性： 可传10代以上

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔胎盘间充质干细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 手术剪、镊子、培养耗材高压灭菌；超净台紫外通风30min。

2. 配制灌洗液 冰预冷D-Hanks液、消化液（胶原酶Ⅳ、透明质酸酶、胰蛋白酶）、DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗、双抗。

3. 健康新西兰大白兔（2.0-2.5kg），3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射，冰浴预冷所有缓冲液。

二、取材与预处理

1. 空气栓塞法处死，75%酒精浸泡消毒体表，无菌操作下暴露并摘取胎盘。

2. 置于冰预冷D-Hanks液中反复漂洗，去除血污及附属组织，仔细剔除结缔组织。

3. 将纯化后的胎盘组织用眼科剪尽量剪碎，尽量减小组织块大小以利消化。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块与胶原酶Ⅳ+透明质酸酶+胰蛋白酶混合酶液按1:3比例混合，37℃振荡消化47min。

2. 加入含20% FBS的培养基中和酶活性，反复吹打使组织充分分散。

3. 细胞悬液经40μm滤网过滤，1次200g×10min离心洗涤，收集细胞。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经40μm滤网过滤，采用适当纯化方法去除杂质细胞，去除未消化组织块。

2. 用DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗调整细胞浓度至120000.0cells/mL，接种于预涂明胶的培养皿中。

3. 置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每2-3天换液一次，倒置显微镜下观察细胞贴壁及形态因细胞类型而异，贴壁或悬浮生长。

取材操作全程在超净台中进行，间充质组织取出后尽快去除血管和结缔组织，用含1% P/S的PBS清洗至组织变白，整个过程温度控制在4°C。

培养板需用1%明胶预包被1小时后PBS洗涤3次，晾干备用，未经处理的培养表面会导致盘间充质干贴壁率低于30%。

该细胞贴壁生长，增殖较为缓慢，每3-4天换液一次，传代比例建议1:2至1:4，长期培养需注意细胞衰老标记物的检测。

培养基配方中MEM-α含10% FBS、1% P/S和5ng/ml bFGF为必需组分，添加顺序和方式需严格按照SOP操作，错误的添加顺序可能导致生长因子失活或沉淀形成。

日常维护中需每日检查细胞形态和培养基颜色，出现浑浊或颜色异常应立即换液并排查污染，传代后24小时内避免换液以利于细胞贴附恢复。