1.介绍：
基于生物物理方法进行蛋白与分子间的亲和力检测一般需要高质量和纯度好的蛋白。然而一些蛋白很难纯化，如膜蛋白等，还有一些蛋白因为不稳定/丰度低/难纯化等问题，无法得到高质量和纯度好的蛋白开展体外分子互作实验。免纯化MST微量热泳动技术提供了一种创新的解决方案。将目的蛋白与GFP融合表达，从而可以在不需要纯化目标蛋白的情况下完成分子互作检测。
佰莱博生物作为MST生物分子互作实验服务的领军者，公司拥有6年的MST实验服务经验，已完成2500+靶点分子检测，在分子间相互作用研究方面经验丰富。利用领先的Monolith NT.115和Monolith X型MST分子互作仪，并结合前沿的免纯化MST技术，能够为难纯化蛋白提供广泛的检测服务，精准分析药物与蛋白、蛋白与小分子、蛋白与蛋白、蛋白与核酸、蛋白与多肽等的亲和力。公司专业分子互作技术团队，为每一位客户量身定制一对一高品质MST微量热泳动检测服务。
2. 微量热泳动技术原理：
MST(MicroScale Thermophoresis)基本原理：溶液中的分子在温度梯度场中定向从高温区向低温区移动，不同分子由于其尺寸、水化层和电荷等物理化学性质的差异，其热泳动速率也各不相同。
采用MST (MicroScale Thermophoresis) 微量热泳动技术检测分子间相互作用的基本原理：检测时将互作中的一个分子进行荧光标记，在MST技术中称之为Target；与之互作的另一个分子称之为Ligand。Target分子与Ligand分子结合形成复合物，复合物分子的尺寸、水化层和电荷等性质相对于Target分子的改变都可以导致复合物分子的热泳动速度相对于Target分子的热泳动速度变快或者变慢。
进行MST实验时将Ligand分子按照2倍的浓度梯度稀释配制16管溶液，然后和Target分子等体积混合，吸入毛细管后放入仪器中进行检测(图1B)。检测时仪器中的红外激光束对毛细管的检测区域正中心进行加热(图1B)，激光束周围的溶液形成温度梯度场，分子在温度梯度溶液中由高温区域向低温区域定向移动，并且移动速度和分子的尺寸大小、水化层及电荷有关。激发光激发Target分子上的荧光基团，通过发射光检测器记录温度梯度场中Target分子发出的荧光强度变化情况(图1C)，图1.C中的横坐标为时间，纵坐标为荧光强度，红色曲线为MST-Trace。
图1.D左图中每一条曲线是一根毛细管中的荧光强度实时记录曲线（MST-Trace），记录了温度梯度场中荧光强度随时间的变化。然后将荧光强度的数值做纵坐标，配体浓度做横坐标进行拟合作图，软件自动计算得到该结合的亲和常数 KD。
图1. 微量热泳动技术 (MST) 原理
免纯化MST微量热泳动技术的核心优势：
1.无需纯化目标蛋白：省去了复杂的蛋白纯化步骤，避免了因纯化过程可能导致的蛋白失活、降解等问题，特别适用于难以纯化的膜蛋白、低丰度蛋白或稳定性差的蛋白。
2. 可检测细胞裂解液 (免纯化MST)、烟草叶片裂解液；
3. 无需固定分子，分子在溶液中处于自由状态。
4. 不受互作的两个分子的分子量比值大小的限制；
5. 可在任意缓冲液中进行检测；
3.免纯化MST 实验流程
3.1 植物免纯化 MST 技术基本流程 (以农杆菌瞬时表达为例)
1. 构建融合表达载体及农杆菌转化：将目标蛋白基因与荧光蛋白（GFP）基因构建到农杆菌表达载体上，并将其转化至农杆菌中。
2. 农杆菌侵染及蛋白表达：将农杆菌按照常规操作侵染4周左右的烟草叶片，2～3天后收集相应的烟草叶片。
3. 蛋白混合物提取并进行 MST 实验：从上述的烟草叶片中提取蛋白混合物，进行 MST 实验。
图2. 植物免纯化 MST 技术基本流程图
3.2细胞免纯化 MST 技术基本流程 (以HEK293T细胞瞬转表达为例)
(1) 构建目的蛋白与 GFP 蛋白融合质粒：将目标蛋白基因与荧光蛋白基因(GFP)构建到真核细胞载体上。
(2) 质粒瞬转：按照常规步骤进行 HEK293T 细胞的复苏、传代及质粒的瞬转，并将转染后的细胞培养2～3天。
(3)免纯化 MST 实验进行分子互作检测：将上述培养的细胞进行裂解，利用细胞裂解液开展免纯化 MST 实验。
图2. 细胞免纯化 MST 技术基本流程图
4. 免MST检测常见的分子互作检测类型：
蛋白与药物、蛋白与小分子化合物、蛋白与蛋白、蛋白与多肽、蛋白与核酸、蛋白与多糖、蛋白与脂质体、蛋白与离子、蛋白与纳米颗粒等
5.常见生物分子间的亲和力范围
6.免纯化MST实验经典案例：
6.1免纯化 MST 技术验证蟾毒灵与 ZFP91 发生相互作用
7. 服务流程
佰莱博生物MST免纯化MST检测的技术优势：
• 设备先进：Monolith NT.115、Monolith X等领先机型，原厂耗材
• 团队专业：6年经验资深分子互作实验团队，2500+靶点分子实验经验
• 检测类型：免纯化MST、亲和力测定、多元互作（竞争结合）
• 数据可靠：多维度优化确保高质量检测数据
• 服务高效：一对一服务，最快48小时交付结果
• 技术互补：SPR/BLI、ITC、分子动力学模拟、CETSA、Co-IP
在提供一流的微量热泳动MST实验服务的同时，佰莱博生物还提供全流程的免纯化MST检测服务(GFP融合蛋白质粒设计合成-质粒瞬转-制备目的蛋白裂解液-免纯化MST实验)。佰莱博还提供生物物理、生物化学、细胞生物学以及计算机模拟等多种分子互作研究技术服务。具体服务内容如下：
(1)生物物理实验：
SPR、MST、ITC、BLI、nanoDSF、CD (圆二色光谱)
(2)生物化学实验：
Pull-Down、 CO-IP、CETSA、DARTS、EMSA
(3) 细胞生物学实验：
小分子免疫荧光(小分子荧光共定位)、FRET、BRET、BiFC
(4) 计算模拟实验：
虚拟筛选、分子对接、分子动力学模拟、基于AI蛋白质设计
