兔胚胎肝母细胞

兔胚胎肝母细胞

基于胰蛋白酶-EDTA消化技术从新西兰大白兔胚胎肝组织中分离原代细胞，在Ham's F12培养基中培养扩增；利用透射电镜(TEM)结合Transwell模型对CD90, SSEA-1进行多参数检测，并通过Western blot验证目标蛋白的表达与功能。

产品名称：兔胚胎肝母细胞

英文名称： Rabbit Embryonic Hepatoblasts

组织来源： 胚胎组织

默认种属 ：兔

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的兔胚胎肝母细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的兔胚胎肝母细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 兔胚胎肝母细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 上皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔胚胎肝母细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 准备无菌手术器械（手术剪、镊子、眼科剪）、培养耗材，高压灭菌后备用；超净工作台紫外消毒。

2. 提前配制冰预冷D-Hanks液、消化液（胶原酶Ⅳ、透明质酸酶）、胰蛋白酶、DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗（37℃预热）、双抗溶液。

3. 健康新西兰大白兔（2.0-2.5kg），3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉，所有试剂冰浴预冷备用。

二、取材与预处理

1. 空气栓塞法处死，碘伏消毒术野，无菌操作取出胚胎组织。

2. 浸入冰预冷D-Hanks液中冲洗干净，仔细分离去除血管、神经及结缔组织。

3. 将组织转移至新的培养皿中，用手术剪精细剪碎成细小碎块。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块加入胶原酶Ⅳ+透明质酸酶混合消化液，37℃消化45min，间断吹打。

2. 加入含10% FBS的培养基终止消化，吹打制备单细胞悬液。

3. 200g离心10min收集细胞沉淀，PBS重悬洗涤两遍。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液过40μm细胞滤网，采用适当纯化方法去除杂质细胞，去除团块和未消化组织。

2. 沉淀细胞用DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗重悬，台盼蓝染色检测活力（应>90%），以60000.0-200000.0cells/cm²密度接种。

3. 放入37℃、5% CO2恒温培养箱，每2-3天换液一次，镜检观察形态因细胞类型而异，贴壁或悬浮生长及生长状态。

实验动物(新西兰大白兔，2.0-3.0kg)需经戊巴比妥钠(30mg/kg)耳缘注射麻醉后，迅速取肝脏组织，整个过程控制在45分钟以内，否则细胞存活率显著降低。

实验用培养皿应提前用0.01%聚鸟氨酸室温孵育2小时，PBS洗涤后风干，该预处理对胎肝母的初始贴附具有决定性作用。

该细胞具有贴壁生长特性，培养过程中需维持培养基pH在7.2-7.4之间，每2天更换新鲜培养基，传代时采用0.25%胰蛋白酶消化。

培养过程中需持续添加DMEM/F12含10% FBS和1%青霉素-链霉素以维持细胞最佳生长状态，抗生素浓度不宜过高以免影响细胞代谢活性，建议常规使用1% P/S即可。

换液时仅更换1/2至2/3体积的新鲜培养基，避免完全换液造成已贴壁细胞脱落，操作时吸管尖端距培养面至少1cm高处缓慢加入。