兔骨髓树突状细胞 (成熟DC细胞)

方法简介  实验室分离的兔骨髓树突状细胞 (成熟DC细胞)采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的兔骨髓树突状细胞 (成熟DC细胞)经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 兔骨髓树突状细胞 (成熟DC细胞)完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 未分化

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔骨髓树突状细胞 (成熟DC细胞)体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：2-3月龄新西兰大白兔，体重2.0-2.5kg，每只可获得1.5-3.0×10⁶个细胞，活力>88%

试剂：0.125%胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、DNase I、BSA、RPMI-1640培养基

分离纯化步骤

采集抗凝全血，用PBS稀释后缓慢铺于Ficoll分离液上层，800g离心20分钟（刹车关），吸取中间白膜层

细胞悬液经200目滤网过滤去除组织碎片，400g离心10分钟收集细胞沉淀，PBS洗涤1次

采用免疫磁珠分选技术（MACS）富集目标免疫细胞亚群，纯度可达90%以上

原代培养要点

细胞悬浮于完全培养基中，按1-5×10⁵ cells/mL密度接种于24孔板，37℃、5% CO₂培养箱悬浮培养

细胞呈悬浮生长，圆形、折光性强，不贴壁，换液时采用半量换液法补充新鲜培养基

常见问题优化

细胞活化状态改变：缩短体外培养时间，避免过度刺激导致细胞表型改变

目标细胞占比低：优化Ficoll梯度离心条件，改进密度梯度分离策略

细胞贴壁率低：免疫细胞本为悬浮生长，注意使用低吸附培养器皿

一、实验前准备

1. 手术器械（剪刀、镊子、止血钳）及培养耗材经121℃高压灭菌20min；超净台紫外照射30min。

2. 配制冰预冷D-Hanks液、RICAM+淋巴细胞分离液混合消化液、RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 双抗 + 50μM β-ME、胎牛血清、双抗，全部冰浴预冷。

3. 健康新西兰大白兔（2.0-2.5kg），3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉处理。

二、取材与预处理

1. 空气栓塞法处死，体表酒精消毒，暴露目标组织器官。

2. 无菌条件下摘取骨髓组织，冰预冷D-Hanks液漂洗去除血液及杂质，去除周围结缔组织和脂肪。

3. 眼科剪将组织剪碎至1mm³小块，转入离心管。

三、细胞分离与消化

1. 剪碎组织加入RICAM消化液，37℃水浴消化36min，期间每隔5-10min振荡吹打。

2. 用含血清培养基终止反应，经200目筛网过滤获取单细胞悬液。

3. 4℃、200g离心10min，弃上清，PBS洗涤两次，重悬细胞沉淀。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经200μm滤膜过滤，采用Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞，去除大颗粒杂质。

2. 用RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 双抗 + 50μM β-ME重悬细胞沉淀，调整接种密度后接种至未涂层预包被的培养器皿。

3. 37℃、5% CO2培养，每2天更换新鲜培养基，定期倒置显微镜观察悬浮或半贴壁生长，圆形或椭圆形，折光性强及生长情况。