兔肾脏微血管内皮细胞

兔肾脏微血管内皮细胞

实验选用日本大耳白兔，取材后迅速转移至预冷的PBS缓冲液中，经胶原酶I/II联合消化获取原代内皮细胞，接种后置于37°C、5% CO2培养箱中，采用含10% FBS的RPMI-1640维持培养，每3天换液一次；细胞鉴定采用ELISA检测VE-cadherin阳性表达率，蛋白质印迹定量Podocalyxin表达量，结合免疫组化(IHC)分析下游通路蛋白表达变化，并通过免疫原性检测验证细胞生物学活性。 经4次传代后仍保持稳定的表型特征。

产品名称：兔肾脏微血管内皮细胞

英文名称： Rabbit Renal Microvascular Endothelial Cells

组织来源： 肾组织

默认种属 ：兔

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的兔肾脏微血管内皮细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的兔肾脏微血管内皮细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 兔肾脏微血管内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔肾脏微血管内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 手术剪、镊子、培养耗材高压灭菌；超净台紫外通风30min。

2. 配制灌洗液 冰预冷D-Hanks液、消化液（Ⅳ型胶原酶、胶原酶Ⅱ、透明质酸酶）、DMEM/F12 + 20% FBS + 50μg/mL 肝素 + 1% 双抗、双抗。

3. 健康新西兰大白兔（2.0-2.5kg），3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射，冰浴预冷所有缓冲液。

二、取材与预处理

1. 空气栓塞法处死，75%酒精浸泡消毒体表，无菌操作下暴露并摘取肾。

2. 置于冰预冷D-Hanks液中反复漂洗，去除血污及附属组织，仔细剔除结缔组织。

3. 将纯化后的肾组织用眼科剪尽量剪碎，尽量减小组织块大小以利消化。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块与Ⅳ型胶原酶+胶原酶Ⅱ+透明质酸酶混合酶液按1:3比例混合，37℃振荡消化41min。

2. 加入含20% FBS的培养基中和酶活性，反复吹打使组织充分分散。

3. 细胞悬液经40μm滤网过滤，2次200g×10min离心洗涤，收集细胞。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经40μm滤网过滤，采用Percoll密度梯度离心纯化内皮细胞，去除未消化组织块。

2. 用DMEM/F12 + 20% FBS + 50μg/mL 肝素 + 1% 双抗调整细胞浓度至110000.0cells/mL，接种于预涂胶原的培养皿中。

3. 置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每2-3天换液一次，倒置显微镜下观察细胞贴壁及鹅卵石样铺路石状排列，贴壁生长，细胞边界清晰。

取材操作全程在超净台中进行，肾脏组织取出后尽快去除血管和结缔组织，用含1% P/S的PBS清洗至组织变白，整个过程温度控制在4°C。

培养板需提前用0.01%多聚赖氨酸包被2小时，使用前PBS洗涤3次，未处理的培养表面会导致脏微血管内皮贴壁不良和形态异常。

该细胞贴壁生长，体外扩增能力有限，建议尽早进行功能实验，连续传代超过8次后细胞可能出现形态改变和标志物表达下调。

培养体系中必须补充GM299培养基含20% FBS、5ng/ml VEGF和10ng/ml FGF，生长因子浓度需严格按照方案配制，浓度过高可能导致细胞异常分化，浓度过低则细胞增殖受限。

换液前先用倒置显微镜观察细胞贴壁情况和形态特征，确认无污染后缓慢吸除旧培养基，沿壁缓慢加入预热的新鲜培养基，避免直接冲洗细胞层。