兔视网膜微血管内皮细胞

方法简介  实验室分离的兔视网膜微血管内皮细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的兔视网膜微血管内皮细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 兔视网膜微血管内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔视网膜微血管内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：2.5-3.5月龄白色家兔，体重2.2-2.8kg，每只可分离1.8-3.2×10⁶个目标细胞，活力>89%

试剂：弹性蛋白酶、胰蛋白酶、EDTA、无钙镁PBS、RPMI-1640培养基

分离纯化步骤

取目标组织用无钙镁PBS洗涤3次，剔除脂肪和结缔组织后剪成小碎片，加入弹性蛋白酶、胰蛋白酶、EDTA、无钙镁PBS消化30-60分钟

消化产物经100目滤网过滤，PBS洗涤1次，400g离心10分钟收集细胞沉淀

细胞沉淀重悬于含10% FBS的培养基中，经Ficoll密度梯度离心（400g，10分钟）纯化目标细胞

原代培养要点

细胞重悬于完全培养基中，按3×10⁴密度接种，置于37℃、5% CO₂恒温培养箱

细胞贴壁后呈典型的铺路石样形态，细胞间连接紧密，第5-7天可达到高密度单层

常见问题优化

细胞贴壁率低：使用合适包被基质（胶原/纤维连接蛋白/多聚赖氨酸），优化接种密度

细胞活力差：严格控制消化时间，除消化步骤外全程冰上操作，使用新鲜配制试剂

培养过程中出现污染：严格无菌操作，培养基中添加适量抗生素，定期检测支原体

一、实验前准备

1. 手术剪、镊子、培养耗材高压灭菌；超净台紫外通风30min。

2. 配制灌洗液 冰预冷D-Hanks液、消化液（Ⅳ型胶原酶+胰蛋白酶）+DNA酶Ⅰ、Neurobasal Medium + B27 + 1% 双抗 + 2mM GlutaMAX、双抗。

3. 健康新西兰大白兔（2.0-2.5kg），3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射，冰浴预冷所有缓冲液。

二、取材与预处理

1. 空气栓塞法处死，75%酒精浸泡消毒体表，无菌操作下暴露并摘取脑。

2. 置于冰预冷D-Hanks液中反复漂洗，去除血污及附属组织，仔细剔除结缔组织。

3. 将纯化后的脑组织用眼科剪尽量剪碎，尽量减小组织块大小以利消化。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块与Ⅳ型胶原酶+胰蛋白酶+DNA酶Ⅰ混合酶液按1:3比例混合，37℃振荡消化41min。

2. 加入含20% FBS的培养基中和酶活性，反复吹打使组织充分分散。

3. 细胞悬液经40μm滤网过滤，2次200g×10min离心洗涤，收集细胞。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经40μm滤网过滤，采用适当纯化方法去除杂质细胞，去除未消化组织块。

2. 用Neurobasal Medium + B27 + 1% 双抗 + 2mM GlutaMAX调整细胞浓度至110000.0cells/mL，接种于预涂明胶的培养皿中。

3. 置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每3天换液一次，倒置显微镜下观察细胞贴壁及多突起状，贴壁生长，可见神经突延伸。