小鼠脾脏单核细胞

小鼠脾脏单核细胞

以BALB/c小鼠为实验来源，经胶原酶消化法处理脾脏单核细胞组织后，通过Percoll密度梯度离心纯化获得细胞，采用含INS/FGF的基础培养基培养；通过流式细胞术检测CD90阳性率，生物膜干涉技术(Biacore)定量vimentin表达量，结合细胞免疫荧光综合评价细胞表型。

产品名称：小鼠脾脏单核细胞

英文名称： Mouse Splenic Monocytes

组织来源： 脾脏组织

默认种属 ：小鼠

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的小鼠脾脏单核细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠脾脏单核细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 小鼠脾脏单核细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 悬浮

细胞形态： 圆形

传代比例： -

传代特性： 不传代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠脾脏单核细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 手术器械（剪刀、镊子、止血钳）及培养耗材经121℃高压灭菌20min；超净台紫外照射30min。

2. 配制冰预冷PBS液、胶原酶Ⅳ+透明质酸酶混合消化液、RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 双抗 + 50μM β-ME、胎牛血清、双抗，全部冰浴预冷。

3. SPF级C57BL/6小鼠（18-22g），戊巴比妥钠腹腔注射麻醉处理。

二、取材与预处理

1. CO2吸入法处死，体表酒精消毒，暴露目标组织器官。

2. 无菌条件下摘取目标组织，冰预冷PBS液漂洗去除血液及杂质，去除周围结缔组织和脂肪。

3. 眼科剪将组织剪碎至1mm³小块，转入离心管。

三、细胞分离与消化

1. 剪碎组织加入胶原酶Ⅳ消化液，37℃水浴消化39min，期间每隔5-10min振荡吹打。

2. 用含血清培养基终止反应，经200目筛网过滤获取单细胞悬液。

3. 4℃、200g离心10min，弃上清，PBS洗涤两次，重悬细胞沉淀。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经200μm滤膜过滤，采用Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞，去除大颗粒杂质。

2. 用RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 双抗 + 50μM β-ME重悬细胞沉淀，调整接种密度后接种至未涂层预包被的培养器皿。

3. 37℃、5% CO2培养，每2天更换新鲜培养基，定期倒置显微镜观察悬浮或半贴壁生长，圆形或椭圆形，折光性强及生长情况。

实验用C57BL/6或BALB/c小鼠(18-22g)经戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射后处死，立即取相应组织置于冰预冷的DMEM培养基中，2小时内完成后续分离操作。

实验前培养器皿需用0.5%明胶溶液包被1小时，PBS冲洗后晾干使用，该步骤对脾脏单核的贴壁和增殖至关重要。

该细胞贴壁生长，体外扩增能力有限，建议尽早进行功能实验，连续传代超过8次后细胞可能出现形态改变和标志物表达下调。

培养基配方中RPMI-1640含10% FBS和1% P/S为必需组分，添加顺序和方式需严格按照SOP操作，错误的添加顺序可能导致生长因子失活或沉淀形成。

换液操作需在生物安全柜中进行，使用预温的培养基缓慢加入培养孔/皿中，避免产生气泡和液流冲击导致细胞脱落或损伤。