小鼠肺动脉内皮细胞

方法简介  实验室分离的小鼠肺动脉内皮细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠肺动脉内皮细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 小鼠肺动脉内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠肺动脉内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：4-6周龄C57BL/6小鼠，体重18-22g，每只可分离0.3-0.8×10⁶个细胞，活力>85%

试剂：中性蛋白酶、胶原酶D、DNA酶I、Ca²⁺/Mg²⁺-free PBS、IMDM培养基

分离纯化步骤

组织块经Hanks液反复冲洗后剪碎，加入中性蛋白酶、胶原酶D、DNA酶I、Ca²⁺/Mg²⁺-free PBS于37℃水浴消化30-45分钟，期间间歇振荡

消化产物经100目滤网过滤，PBS洗涤1次，400g离心10分钟收集细胞沉淀

利用免疫磁珠分选技术（MACS）纯化目标细胞，纯度可达90%以上

原代培养要点

调整细胞密度至1-2×10⁵接种于预处理培养皿，37℃、5% CO₂培养箱培养

内皮细胞生长需要较高的血清浓度和血管内皮生长因子支持，注意维持培养基新鲜度

常见问题优化

细胞贴壁率低：使用合适包被基质（胶原/纤维连接蛋白/多聚赖氨酸），优化接种密度

目标细胞占比低：优化消化条件提高目标细胞得率，改进分离策略减少非目标细胞污染

细胞活力差：严格控制消化时间，除消化步骤外全程冰上操作，使用新鲜配制试剂

一、实验前准备

1. 准备无菌手术器械（手术剪、镊子、眼科剪）、培养耗材，高压灭菌后备用；超净工作台紫外消毒。

2. 提前配制冰预冷PBS液、消化液（Ⅳ型胶原酶、透明质酸酶）、弹性蛋白酶、DMEM/F12 + 20% FBS + 50μg/mL 肝素 + 1% 双抗（37℃预热）、双抗溶液。

3. SPF级C57BL/6小鼠（18-22g），戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，所有试剂冰浴预冷备用。

二、取材与预处理

1. CO2吸入法处死，碘伏消毒术野，无菌操作取出肺组织。

2. 浸入冰预冷PBS液中冲洗干净，仔细分离去除血管、神经及结缔组织。

3. 将组织转移至新的培养皿中，用手术剪精细剪碎成细小碎块。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块加入Ⅳ型胶原酶+透明质酸酶混合消化液，37℃消化39min，间断吹打。

2. 加入含10% FBS的培养基终止消化，吹打制备单细胞悬液。

3. 200g离心10min收集细胞沉淀，PBS重悬洗涤两遍。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液过40μm细胞滤网，采用Percoll密度梯度离心纯化内皮细胞，去除团块和未消化组织。

2. 沉淀细胞用DMEM/F12 + 20% FBS + 50μg/mL 肝素 + 1% 双抗重悬，台盼蓝染色检测活力（应>90%），以60000.0-240000.0cells/cm²密度接种。

3. 放入37℃、5% CO2恒温培养箱，每2-3天换液一次，镜检观察鹅卵石样铺路石状排列，贴壁生长，细胞边界清晰及生长状态。