小鼠食管成纤维细胞

小鼠食管成纤维细胞

实验选用KM小鼠，取材后迅速转移至预冷的PBS缓冲液中，经胰蛋白酶-EDTA消化联合密度梯度离心获取原代成纤维细胞，接种后置于37°C、5% CO2培养箱中，采用K-SFM基础培养基维持培养，每3天换液一次；细胞鉴定采用ATAC-seq检测CD90阳性表达率，免疫组化(IHC)定量Collagen III表达量，结合Western blot分析下游通路蛋白表达变化，并通过免疫原性检测验证细胞生物学活性。 冻存复苏后细胞存活率可达85%以上。

产品名称：小鼠食管成纤维细胞

英文名称： Mouse Esophageal Fibroblasts

组织来源： 食管组织

默认种属 ：小鼠

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的小鼠食管成纤维细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠食管成纤维细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 小鼠食管成纤维细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:3

传代特性： 可传5-8代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠食管成纤维细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 准备无菌手术器械（手术剪、镊子、眼科剪）、培养耗材，高压灭菌后备用；超净工作台紫外消毒。

2. 提前配制冰预冷PBS液、消化液（胶原酶Ⅰ、透明质酸酶）、K-SFM培养基 + EGF + BSA（37℃预热）、双抗溶液。

3. SPF级C57BL/6小鼠（18-22g），戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，所有试剂冰浴预冷备用。

二、取材与预处理

1. CO2吸入法处死，碘伏消毒术野，无菌操作取出食管组织。

2. 浸入冰预冷PBS液中冲洗干净，仔细分离去除血管、神经及结缔组织。

3. 将组织转移至新的培养皿中，用手术剪精细剪碎成细小碎块。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块加入胶原酶Ⅰ+透明质酸酶混合消化液，37℃消化46min，间断吹打。

2. 加入含10% FBS的培养基终止消化，吹打制备单细胞悬液。

3. 200g离心10min收集细胞沉淀，PBS重悬洗涤两遍。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液过40μm细胞滤网，采用适当纯化方法去除杂质细胞，去除团块和未消化组织。

2. 沉淀细胞用K-SFM培养基 + EGF + BSA重悬，台盼蓝染色检测活力（应>90%），以60000.0-210000.0cells/cm²密度接种。

3. 放入37℃、5% CO2恒温培养箱，每2天换液一次，镜检观察多角形或铺路石样排列，贴壁生长，细胞间紧密连接及生长状态。

取材操作全程在超净台中进行，食管组织取出后尽快去除血管和结缔组织，用含1% P/S的PBS清洗至组织变白，整个过程温度控制在4°C。

培养板需用1%明胶预包被1小时后PBS洗涤3次，晾干备用，未经处理的培养表面会导致食管成纤维贴壁率低于30%。

该细胞贴壁生长，每2-3天换液一次，传代比例为1:2至1:3，过度传代(>P5)会导致细胞衰老和功能性下降。

培养体系中必须补充DMEM/F12含10% FBS和1%青霉素-链霉素，生长因子浓度需严格按照方案配制，浓度过高可能导致细胞异常分化，浓度过低则细胞增殖受限。

每次换液前应观察细胞形态和密度，弃去旧培养基时动作轻柔沿壁缓慢吸除，避免扰动贴壁细胞层，新培养基预热至37°C后使用。