小鼠颅盖造骨细胞

小鼠颅盖造骨细胞

从C57BL/6小鼠的颅盖组织中分离纯化造骨，采用免疫磁珠分选(MACS)获得高纯度细胞群体，在含10%胎牛血清的完全培养基下扩增培养；运用ATAC-seq检测CD90, CD73标志物表达，通过Western blot分析蛋白表达谱，并结合单细胞RNA测序(scRNA-seq)综合评价细胞表型特征。

产品名称：小鼠颅盖造骨细胞

英文名称： Mouse Calvarial Osteoblasts

组织来源： 颅盖骨组织

默认种属 ：小鼠

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的小鼠颅盖造骨细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠颅盖造骨细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 小鼠颅盖造骨细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 多边形

传代比例： 1:3

传代特性： 可传5-8代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠颅盖造骨细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 准备无菌手术器械（手术剪、镊子、眼科剪）、培养耗材，高压灭菌后备用；超净工作台紫外消毒。

2. 提前配制冰预冷PBS液、消化液（Ⅰ型胶原酶、胶原酶Ⅱ）、透明质酸酶、α-MEM + 10% FBS + 1% 双抗 + 50μg/mL 抗坏血酸（37℃预热）、双抗溶液。

3. SPF级C57BL/6小鼠（18-22g），戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，所有试剂冰浴预冷备用。

二、取材与预处理

1. CO2吸入法处死，碘伏消毒术野，无菌操作取出骨骼组织。

2. 浸入冰预冷PBS液中冲洗干净，仔细分离去除血管、神经及结缔组织。

3. 将组织转移至新的培养皿中，用手术剪精细剪碎成细小碎块。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块加入Ⅰ型胶原酶+胶原酶Ⅱ混合消化液，37℃消化37min，间断吹打。

2. 加入含10% FBS的培养基终止消化，吹打制备单细胞悬液。

3. 200g离心10min收集细胞沉淀，PBS重悬洗涤两遍。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液过40μm细胞滤网，采用适当纯化方法去除杂质细胞，去除团块和未消化组织。

2. 沉淀细胞用α-MEM + 10% FBS + 1% 双抗 + 50μg/mL 抗坏血酸重悬，台盼蓝染色检测活力（应>90%），以60000.0-220000.0cells/cm²密度接种。

3. 放入37℃、5% CO2恒温培养箱，每3天换液一次，镜检观察多角形或梭形，贴壁生长，可观察到矿化结节及生长状态。

取材时必须在冰上低温操作，30分钟内完成骨组织的分离与纯化处理，室温暴露时间过长会直接导致细胞活性下降40%以上。

实验用培养皿应提前用0.01%聚鸟氨酸室温孵育2小时，PBS洗涤后风干，该预处理对颅盖造骨的初始贴附具有决定性作用。

该细胞贴壁生长，每2-3天换液一次，传代比例为1:2至1:3，过度传代(>P5)会导致细胞衰老和功能性下降。

培养基配方中α-MEM含10% FBS、1% P/S、50μg/ml维生素C和10mM β-甘油磷酸钠为必需组分，添加顺序和方式需严格按照SOP操作，错误的添加顺序可能导致生长因子失活或沉淀形成。

日常维护中需每日检查细胞形态和培养基颜色，出现浑浊或颜色异常应立即换液并排查污染，传代后24小时内避免换液以利于细胞贴附恢复。