小鼠颞下颌关节软骨细胞

方法简介  实验室分离的小鼠颞下颌关节软骨细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠颞下颌关节软骨细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 小鼠颞下颌关节软骨细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 多边形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠颞下颌关节软骨细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：6-8周龄BALB/c小鼠，体重20-25g，单只取材获0.4-0.9×10⁶个细胞，活率>88%

试剂：胶原酶Type VIII、胰蛋白酶、透明质酸酶、FBS、IMDM培养基

分离纯化步骤

组织块经Hanks液反复冲洗后剪碎，加入胶原酶Type VIII、胰蛋白酶、透明质酸酶、FBS于37℃水浴消化120-180分钟，期间间歇振荡

细胞悬液依次过70目、100目滤网去除未消化组织块，收集滤液后离心收集细胞

经Percoll不连续密度梯度离心（500g/500g，12分钟）分离纯化目标细胞层

原代培养要点

调整细胞浓度至2×10⁴，接种于胶原/纤维连接蛋白包被的培养皿中，37℃、5% CO₂培养

软骨细胞传代后易去分化，建议低传代次数使用（P2以内）以维持表型

常见问题优化

细胞贴壁率低：使用合适包被基质（胶原/纤维连接蛋白/多聚赖氨酸），优化接种密度

纯度不达标：优化密度梯度离心条件，延长免疫磁珠孵育时间，增加洗涤步骤

细胞形态异常：检查培养基pH值和渗透压，避免过度传代导致细胞老化

一、实验前准备

1. 手术剪、镊子、培养耗材高压灭菌；超净台紫外通风30min。

2. 配制灌洗液 冰预冷PBS液、消化液（胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、透明质酸酶）、DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗 + 10ng/mL TGF-β、双抗。

3. SPF级C57BL/6小鼠（18-22g），戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，冰浴预冷所有缓冲液。

二、取材与预处理

1. CO2吸入法处死，75%酒精浸泡消毒体表，无菌操作下暴露并摘取关节。

2. 置于冰预冷PBS液中反复漂洗，去除血污及附属组织，仔细剔除结缔组织。

3. 将纯化后的关节组织用眼科剪尽量剪碎，尽量减小组织块大小以利消化。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块与胶原酶Ⅰ+胶原酶Ⅱ+透明质酸酶混合酶液按1:3比例混合，37℃振荡消化41min。

2. 加入含20% FBS的培养基中和酶活性，反复吹打使组织充分分散。

3. 细胞悬液经40μm滤网过滤，2次200g×10min离心洗涤，收集细胞。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经40μm滤网过滤，采用适当纯化方法去除杂质细胞，去除未消化组织块。

2. 用DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗 + 10ng/mL TGF-β调整细胞浓度至110000.0cells/mL，接种于预涂明胶的培养皿中。

3. 置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每3天换液一次，倒置显微镜下观察细胞贴壁及圆形或椭圆形，贴壁生长，胞质丰富，可见基质分泌。