5羟二十碳四烯酸(5-HETE)ELISA试剂盒

5羟二十碳四烯酸(5-HETE)ELISA试剂盒

试剂盒预先包被5羟二十碳四烯酸(5-HETE)捕获抗体的微孔中依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体经过温育并彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化为蓝色在酸的作用下最终转化为黄色颜色深浅与样本中5-hydroxyeicosatetraenoic acid,5-HETE的含量呈正相关。

1、血清：室温血液自然凝固10-20分钟，2000-3000转/分离心20分钟收集上清。

2、血浆：用EDTA或柠檬酸钠抗凝，混匀10-20分钟后2000-3000转/分离心20分钟取上清。

3、组织标本：称重后加pH7.4的PBS匀浆，液氮速冻后融化，2000-3000转/分离心20分钟取上清。

4、样本采集后24小时内完成检测，暂不检测可分装-20℃冻存，避免反复冻融。

操作步骤：

1、所有试剂提前从冰箱取出，平衡至室温后再使用，浓洗涤液盐析出时可37℃水浴助溶稀释。

2、设置标准品孔、待测样本孔，每孔分别加入梯度标准品或处理好的待测样本100μL，37℃孵育90分钟。

3、弃去孔内液体，不用洗涤，直接加入新鲜稀释的生物素化抗体工作液100μL，37℃孵育60分钟。

4、弃去液体后洗板3次，每次浸泡1-2分钟，拍干后加入酶结合物工作液100μL，37℃避光孵育30分钟。

5、弃去液体后洗板5次，每孔加入底物溶液90μL，37℃避光孵育10-20分钟，可见孔内出现蓝色梯度。

6、每孔快速加入终止液50μL，颜色由蓝立即转为黄色，15分钟内用酶标仪在450nm波长读取OD值。

一、全程避免样本溶血：红细胞破裂释放的内源性过氧化物酶，会直接干扰HRP标记抗体的酶促反应，引发非特异性显色，导致结果虚高。

二、样本避免反复冻融：反复冻融导致蛋白降解、聚合，破坏抗原的天然构象，无法被包被抗体和检测抗体识别，定量结果大幅偏低。

不同批号试剂严禁混用：不同批次的捕获抗体、酶标抗体效价存在差异，混用会打破“三明治”免疫复合物的结合比例，直接破坏标准曲线的线性关系。

温育条件严格统一：所有反应孔的温育时间、温度必须完全一致，37℃环境下精准控制孵育时长，避免免疫结合效率不均，导致孔间结果偏差。