小鼠冠状动脉成纤维细胞

方法简介  实验室分离的小鼠冠状动脉成纤维细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠冠状动脉成纤维细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 小鼠冠状动脉成纤维细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:3

传代特性： 可传5-8代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠冠状动脉成纤维细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：6-8周龄BALB/c小鼠，体重20-25g，单只取材获0.4-0.9×10⁶个细胞，活率>88%

试剂：Dispase、Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶、Hanks液、α-MEM培养基

分离纯化步骤

取目标组织用无钙镁PBS洗涤3次，剔除脂肪和结缔组织后剪成小碎片，加入Dispase、Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶、Hanks液消化30-60分钟

消化产物经100目滤网过滤，PBS洗涤1次，400g离心10分钟收集细胞沉淀

细胞沉淀重悬于含10% FBS的培养基中，经Ficoll密度梯度离心（400g，10分钟）纯化目标细胞

原代培养要点

调整细胞浓度至3×10⁴，接种于胶原/纤维连接蛋白包被的培养皿中，37℃、5% CO₂培养

原代细胞贴壁生长，形态典型，接种后48小时开始增殖，第5-7天可达到亚融合状态

常见问题优化

细胞形态异常：检查培养基pH值和渗透压，避免过度传代导致细胞老化

细胞活力差：严格控制消化时间，除消化步骤外全程冰上操作，使用新鲜配制试剂

纯度不达标：优化密度梯度离心条件，延长免疫磁珠孵育时间，增加洗涤步骤

一、实验前准备

1. 准备无菌手术器械（手术剪、镊子、眼科剪）、培养耗材，高压灭菌后备用；超净工作台紫外消毒。

2. 提前配制冰预冷PBS液、消化液（Ⅳ型胶原酶、弹性蛋白酶）、透明质酸酶、DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗（37℃预热）、双抗溶液。

3. SPF级C57BL/6小鼠（18-22g），戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，所有试剂冰浴预冷备用。

二、取材与预处理

1. CO2吸入法处死，碘伏消毒术野，无菌操作取出心脏组织。

2. 浸入冰预冷PBS液中冲洗干净，仔细分离去除血管、神经及结缔组织。

3. 将组织转移至新的培养皿中，用手术剪精细剪碎成细小碎块。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块加入Ⅳ型胶原酶+弹性蛋白酶混合消化液，37℃消化38min，间断吹打。

2. 加入含10% FBS的培养基终止消化，吹打制备单细胞悬液。

3. 200g离心10min收集细胞沉淀，PBS重悬洗涤两遍。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液过40μm细胞滤网，采用适当纯化方法去除杂质细胞，去除团块和未消化组织。

2. 沉淀细胞用DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗重悬，台盼蓝染色检测活力（应>90%），以60000.0-230000.0cells/cm²密度接种。

3. 放入37℃、5% CO2恒温培养箱，每2-3天换液一次，镜检观察形态因细胞类型而异，贴壁或悬浮生长及生长状态。