小鼠肺小动脉内皮细胞

小鼠肺小动脉内皮细胞

从KM小鼠的肺小动脉组织中分离纯化内皮细胞，采用免疫荧光分选获得高纯度细胞群体，在Ham's F12培养基下扩增培养；运用钙成像检测Podocalyxin, Tie-2标志物表达，通过钙流检测分析蛋白表达谱，并结合流式细胞术综合评价细胞表型特征。

产品名称：小鼠肺小动脉内皮细胞

英文名称： Mouse Pulmonary Arteriolar Endothelial Cells

组织来源： 肺组织

默认种属 ：小鼠

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的小鼠肺小动脉内皮细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠肺小动脉内皮细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 小鼠肺小动脉内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠肺小动脉内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 手术剪、镊子、培养耗材高压灭菌；超净台紫外通风30min。

2. 配制灌洗液 冰预冷PBS液、消化液（Ⅳ型胶原酶+透明质酸酶）+弹性蛋白酶、DMEM/F12 + 20% FBS + 50μg/mL 肝素 + 1% 双抗、双抗。

3. SPF级C57BL/6小鼠（18-22g），戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，冰浴预冷所有缓冲液。

二、取材与预处理

1. CO2吸入法处死，75%酒精浸泡消毒体表，无菌操作下暴露并摘取肺。

2. 置于冰预冷PBS液中反复漂洗，去除血污及附属组织，仔细剔除结缔组织。

3. 将纯化后的肺组织用眼科剪尽量剪碎，尽量减小组织块大小以利消化。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块与Ⅳ型胶原酶+透明质酸酶+弹性蛋白酶混合酶液按1:3比例混合，37℃振荡消化47min。

2. 加入含20% FBS的培养基中和酶活性，反复吹打使组织充分分散。

3. 细胞悬液经40μm滤网过滤，1次200g×10min离心洗涤，收集细胞。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经40μm滤网过滤，采用Percoll密度梯度离心纯化内皮细胞，去除未消化组织块。

2. 用DMEM/F12 + 20% FBS + 50μg/mL 肝素 + 1% 双抗调整细胞浓度至120000.0cells/mL，接种于预涂胶原的培养皿中。

3. 置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每2-3天换液一次，倒置显微镜下观察细胞贴壁及鹅卵石样铺路石状排列，贴壁生长，细胞边界清晰。

C57BL/6或BALB/c小鼠经戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射后，无菌操作下取出动脉血管组织，迅速去除周围脂肪组织和结缔组织，用预冷HBSS洗涤3次备用。

培养板需提前用0.01%多聚赖氨酸包被2小时，使用前PBS洗涤3次，未处理的培养表面会导致肺小动脉内皮贴壁不良和形态异常。

该细胞贴壁生长，体外扩增能力有限，建议尽早进行功能实验，连续传代超过8次后细胞可能出现形态改变和标志物表达下调。

培养基中需添加GM299培养基含20% FBS、5ng/ml VEGF和10ng/ml FGF，其中血清浓度应根据细胞生长状态适当调整，低血清条件有助于减少杂细胞污染但可能影响肺小动脉内皮增殖速度。

换液前先用倒置显微镜观察细胞贴壁情况和形态特征，确认无污染后缓慢吸除旧培养基，沿壁缓慢加入预热的新鲜培养基，避免直接冲洗细胞层。