小鼠骨髓树突状细胞(未成熟DC细胞)

方法简介  实验室分离的小鼠骨髓树突状细胞(未成熟DC细胞)采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠骨髓树突状细胞(未成熟DC细胞)经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 小鼠骨髓树突状细胞(未成熟DC细胞)完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 未分化

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠骨髓树突状细胞(未成熟DC细胞)体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：5-7周龄ICR小鼠，体重18-24g，每只取材获0.35-0.75×10⁶个细胞，活力>86%

试剂：胶原酶Type VIII、胰蛋白酶、透明质酸酶、FBS、IMDM培养基

分离纯化步骤

抗凝血液经Ficoll-Hypaque梯度离心分离外周血单个核细胞（PBMCs），PBS洗涤后重悬

细胞悬液经200目滤网过滤去除组织碎片，400g离心10分钟收集细胞沉淀，PBS洗涤1次

利用CD45磁珠阳性选择策略特异性富集白细胞，纯度>90%

原代培养要点

细胞重悬于含相应细胞因子的完全培养基中，按适当密度接种于低吸附培养皿，37℃、5% CO₂培养

悬浮培养条件下细胞活性保持稳定，每2天半量换液维持细胞密度

常见问题优化

细胞贴壁率低：免疫细胞本为悬浮生长，注意使用低吸附培养器皿

细胞活力差：操作全程保持低温，使用新鲜配制试剂，离心力不宜过高

培养过程中出现污染：严格无菌操作，培养基中添加适量抗生素，定期检测支原体

一、实验前准备

1. 手术器械（剪刀、镊子、止血钳）及培养耗材经121℃高压灭菌20min；超净台紫外照射30min。

2. 配制冰预冷PBS液、RICAM+淋巴细胞分离液混合消化液、RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 双抗 + 50μM β-ME、胎牛血清、双抗，全部冰浴预冷。

3. SPF级C57BL/6小鼠（18-22g），戊巴比妥钠腹腔注射麻醉处理。

二、取材与预处理

1. CO2吸入法处死，体表酒精消毒，暴露目标组织器官。

2. 无菌条件下摘取骨髓组织，冰预冷PBS液漂洗去除血液及杂质，去除周围结缔组织和脂肪。

3. 眼科剪将组织剪碎至1mm³小块，转入离心管。

三、细胞分离与消化

1. 剪碎组织加入RICAM消化液，37℃水浴消化36min，期间每隔5-10min振荡吹打。

2. 用含血清培养基终止反应，经200目筛网过滤获取单细胞悬液。

3. 4℃、200g离心10min，弃上清，PBS洗涤两次，重悬细胞沉淀。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经200μm滤膜过滤，采用Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞，去除大颗粒杂质。

2. 用RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 双抗 + 50μM β-ME重悬细胞沉淀，调整接种密度后接种至未涂层预包被的培养器皿。

3. 37℃、5% CO2培养，每2天更换新鲜培养基，定期倒置显微镜观察悬浮或半贴壁生长，圆形或椭圆形，折光性强及生长情况。