小鼠外周血树突状细胞(未成熟DC细胞)

小鼠外周血树突状细胞(未成熟DC细胞)

以KM小鼠为实验来源，经弹性蛋白酶消化法处理(未成熟DC细胞)组织后，通过Ficoll-Hypaque梯度离心纯化获得外周血树突状细胞，采用Ham's F12培养基培养；通过免疫荧光双标技术检测CD83阳性率，表面增强拉曼散射(SERS)定量CD11c表达量，结合流式细胞术综合评价细胞表型。

产品名称：小鼠外周血树突状细胞(未成熟DC细胞)

英文名称： Mouse Peripheral Blood Immature Dendritic Cells

组织来源： 外周血组织

默认种属 ：小鼠

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的小鼠外周血树突状细胞(未成熟DC细胞)采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠外周血树突状细胞(未成熟DC细胞)经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 小鼠外周血树突状细胞(未成熟DC细胞)完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 未分化

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠外周血树突状细胞(未成熟DC细胞)体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 手术器械（剪刀、镊子、止血钳）及培养耗材经121℃高压灭菌20min；超净台紫外照射30min。

2. 配制冰预冷PBS液、胶原酶Ⅳ+透明质酸酶混合消化液、RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 双抗 + 50μM β-ME、胎牛血清、双抗，全部冰浴预冷。

3. SPF级C57BL/6小鼠（18-22g），戊巴比妥钠腹腔注射麻醉处理。

二、取材与预处理

1. CO2吸入法处死，体表酒精消毒，暴露目标组织器官。

2. 无菌条件下摘取目标组织，冰预冷PBS液漂洗去除血液及杂质，去除周围结缔组织和脂肪。

3. 眼科剪将组织剪碎至1mm³小块，转入离心管。

三、细胞分离与消化

1. 剪碎组织加入胶原酶Ⅳ消化液，37℃水浴消化33min，期间每隔5-10min振荡吹打。

2. 用含血清培养基终止反应，经200目筛网过滤获取单细胞悬液。

3. 4℃、200g离心10min，弃上清，PBS洗涤两次，重悬细胞沉淀。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经200μm滤膜过滤，采用Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞，去除大颗粒杂质。

2. 用RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 双抗 + 50μM β-ME重悬细胞沉淀，调整接种密度后接种至未涂层预包被的培养器皿。

3. 37℃、5% CO2培养，每2天更换新鲜培养基，定期倒置显微镜观察悬浮或半贴壁生长，圆形或椭圆形，折光性强及生长情况。

取材时必须在冰上低温操作，30分钟内完成相应组织的分离与纯化处理，室温暴露时间过长会直接导致细胞活性下降40%以上。

培养板需用1%明胶预包被1小时后PBS洗涤3次，晾干备用，未经处理的培养表面会导致外周血树突状(未成熟DC)贴壁率低于30%。

该细胞贴壁生长，增殖较为缓慢，每3-4天换液一次，传代比例建议1:2至1:4，长期培养需注意细胞衰老标记物的检测。

培养过程中需持续添加RPMI-1640含10% FBS、20ng/ml IL-4和20ng/ml GM-CSF以维持细胞最佳生长状态，抗生素浓度不宜过高以免影响细胞代谢活性，建议常规使用1% P/S即可。

日常维护中需每日检查细胞形态和培养基颜色，出现浑浊或颜色异常应立即换液并排查污染，传代后24小时内避免换液以利于细胞贴附恢复。