大鼠骨髓造血干细胞

大鼠骨髓造血干细胞

从SD大鼠的相关组织中分离纯化骨髓造血干细胞，采用密度梯度离心法获得高纯度细胞群体，在含FGF/bFGF的专用培养基下扩增培养；运用co-IP检测Sox2, Nanog标志物表达，通过数字PCR(dPCR)分析蛋白表达谱，并结合线粒体膜电位检测综合评价细胞表型特征。

产品名称：大鼠骨髓造血干细胞

英文名称： Rat Bone Marrow Hematopoietic Stem Cells

组织来源： 骨髓组织

默认种属 ：大鼠

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的大鼠骨髓造血干细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠骨髓造血干细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 大鼠骨髓造血干细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 悬浮

细胞形态： 圆形

传代比例： -

传代特性： 不传代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠骨髓造血干细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 手术器械（剪刀、镊子、止血钳）及培养耗材经121℃高压灭菌20min；超净台紫外照射30min。

2. 配制冰预冷D-Hanks液、RICAM+淋巴细胞分离液混合消化液、α-MEM + 10% FBS + 1% 双抗、胎牛血清、双抗，全部冰浴预冷。

3. SPF级SD大鼠（200-250g），10%水合氯醛腹腔注射麻醉处理。

二、取材与预处理

1. 颈椎脱臼处死，体表酒精消毒，暴露目标组织器官。

2. 无菌条件下摘取骨髓组织，冰预冷D-Hanks液漂洗去除血液及杂质，去除周围结缔组织和脂肪。

3. 眼科剪将组织剪碎至1mm³小块，转入离心管。

三、细胞分离与消化

1. 剪碎组织加入RICAM消化液，37℃水浴消化27min，期间每隔5-10min振荡吹打。

2. 用含血清培养基终止反应，经200目筛网过滤获取单细胞悬液。

3. 4℃、200g离心10min，弃上清，PBS洗涤两次，重悬细胞沉淀。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经40μm滤膜过滤，采用Percoll密度梯度离心富集干细胞，去除大颗粒杂质。

2. 用α-MEM + 10% FBS + 1% 双抗重悬细胞沉淀，调整接种密度后接种至明胶预包被的培养器皿。

3. 37℃、5% CO2培养，每2天换液一次，定期倒置显微镜观察梭形或多角形，贴壁生长，核质比高，核仁明显及生长情况。

取材操作全程在超净台中进行，骨组织取出后尽快去除血管和结缔组织，用含1% P/S的PBS清洗至组织变白，整个过程温度控制在4°C。

培养器皿必须提前用0.1mg/ml胶原酶I包被过夜，未包被的培养板骨髓造血干贴壁效率极低，影响后续实验结果。

该细胞贴壁生长，体外扩增能力有限，建议尽早进行功能实验，连续传代超过8次后细胞可能出现形态改变和标志物表达下调。

培养体系中必须补充IMDM含20% FBS、1% P/S、50ng/ml SCF和20ng/ml IL-3，生长因子浓度需严格按照方案配制，浓度过高可能导致细胞异常分化，浓度过低则细胞增殖受限。

每次换液前应观察细胞形态和密度，弃去旧培养基时动作轻柔沿壁缓慢吸除，避免扰动贴壁细胞层，新培养基预热至37°C后使用。