大鼠脊髓微血管内皮细胞

大鼠脊髓微血管内皮细胞

实验选用SD大鼠，取材后迅速转移至预冷的PBS缓冲液中，经组织块贴壁法获取原代内皮细胞，接种后置于37°C、5% CO2培养箱中，采用DMEM/F12+10% FBS+1%双抗维持培养，每3天换液一次；细胞鉴定采用数字PCR(dPCR)检测CD31阳性表达率，Nanostring数字计数定量Tie-2表达量，结合Western blot分析下游通路蛋白表达变化，并通过管腔形成实验验证细胞生物学活性。

产品名称：大鼠脊髓微血管内皮细胞

英文名称： Rat Spinal Cord Microvascular Endothelial Cells

组织来源： 脊髓组织

默认种属 ：大鼠

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的大鼠脊髓微血管内皮细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠脊髓微血管内皮细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 大鼠脊髓微血管内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠脊髓微血管内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 手术器械（剪刀、镊子、止血钳）及培养耗材经121℃高压灭菌20min；超净台紫外照射30min。

2. 配制冰预冷D-Hanks液、Ⅳ型胶原酶+胰蛋白酶混合消化液、Neurobasal Medium + B27 + 1% 双抗 + 2mM GlutaMAX、胎牛血清、双抗，全部冰浴预冷。

3. SPF级SD大鼠（200-250g），10%水合氯醛腹腔注射麻醉处理。

二、取材与预处理

1. 颈椎脱臼处死，体表酒精消毒，暴露目标组织器官。

2. 无菌条件下摘取脑组织，冰预冷D-Hanks液漂洗去除血液及杂质，去除周围结缔组织和脂肪。

3. 眼科剪将组织剪碎至1mm³小块，转入离心管。

三、细胞分离与消化

1. 剪碎组织加入Ⅳ型胶原酶消化液，37℃水浴消化33min，期间每隔5-10min振荡吹打。

2. 用含血清培养基终止反应，经200目筛网过滤获取单细胞悬液。

3. 4℃、200g离心10min，弃上清，PBS洗涤两次，重悬细胞沉淀。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经40μm滤膜过滤，采用适当纯化方法去除杂质细胞，去除大颗粒杂质。

2. 用Neurobasal Medium + B27 + 1% 双抗 + 2mM GlutaMAX重悬细胞沉淀，调整接种密度后接种至明胶预包被的培养器皿。

3. 37℃、5% CO2培养，每3天换液一次，定期倒置显微镜观察多突起状，贴壁生长，可见神经突延伸及生长情况。

SD大鼠或Wistar大鼠经10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射后，无菌操作下取出脊髓组织，迅速去除周围脂肪组织和结缔组织，用预冷HBSS洗涤3次备用。

培养板需提前用0.01%多聚赖氨酸包被2小时，使用前PBS洗涤3次，未处理的培养表面会导致脊髓微血管内皮贴壁不良和形态异常。

该细胞为贴壁型细胞，体外培养条件下可稳定增殖，建议每2-3天换液，传代比例1:3，培养温度严格控制在37°C。

培养过程中需持续添加GM299培养基含20% FBS、5ng/ml VEGF和10ng/ml FGF以维持细胞最佳生长状态，抗生素浓度不宜过高以免影响细胞代谢活性，建议常规使用1% P/S即可。

换液操作需在生物安全柜中进行，使用预温的培养基缓慢加入培养孔/皿中，避免产生气泡和液流冲击导致细胞脱落或损伤。