大鼠骨髓树突状细胞(成熟DC细胞)

方法简介  实验室分离的大鼠骨髓树突状细胞(成熟DC细胞)采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠骨髓树突状细胞(成熟DC细胞)经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 大鼠骨髓树突状细胞(成熟DC细胞)完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 未分化

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠骨髓树突状细胞(成熟DC细胞)体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：5-7周龄雌性SD大鼠，体重170-210g，每只取材获0.7-1.4×10⁶个细胞，活力>87%

试剂：0.25%胰蛋白酶-EDTA、Ⅳ型胶原酶、I型胶原酶、BSA、DMEM高糖培养基

分离纯化步骤

取抗凝血经PBS 1:1稀释后，加入Ficoll密度梯度液上层，室温800g离心20分钟，仔细吸取界面单层核细胞

细胞悬液经200目滤网过滤去除组织碎片，400g离心10分钟收集细胞沉淀，PBS洗涤1次

经Percoll不连续密度梯度离心分离目标细胞层，PBS洗涤后收集

原代培养要点

细胞重悬于含相应细胞因子的完全培养基中，按适当密度接种于低吸附培养皿，37℃、5% CO₂培养

免疫细胞体外存活期有限，建议实验在取材后7-14天内完成，期间定期检测细胞活力

常见问题优化

目标细胞占比低：优化Ficoll梯度离心条件，改进密度梯度分离策略

培养过程中出现污染：严格无菌操作，培养基中添加适量抗生素，定期检测支原体

细胞贴壁率低：免疫细胞本为悬浮生长，注意使用低吸附培养器皿

一、实验前准备

1. 手术剪、镊子、培养耗材高压灭菌；超净台紫外通风30min。

2. 配制灌洗液 冰预冷D-Hanks液、消化液（RICAM、淋巴细胞分离液、NH4Cl）、RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 双抗 + 50μM β-ME、双抗。

3. SPF级SD大鼠（200-250g），10%水合氯醛腹腔注射麻醉，冰浴预冷所有缓冲液。

二、取材与预处理

1. 颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡消毒体表，无菌操作下暴露并摘取骨髓。

2. 置于冰预冷D-Hanks液中反复漂洗，去除血污及附属组织，仔细剔除结缔组织。

3. 将纯化后的骨髓组织用眼科剪尽量剪碎，尽量减小组织块大小以利消化。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块与RICAM+淋巴细胞分离液+NH4Cl混合酶液按1:3比例混合，37℃振荡消化35min。

2. 加入含20% FBS的培养基中和酶活性，反复吹打使组织充分分散。

3. 细胞悬液经40μm滤网过滤，1次200g×10min离心洗涤，收集细胞。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经200μm滤网过滤，采用Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞，去除未消化组织块。

2. 用RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 双抗 + 50μM β-ME调整细胞浓度至100000.0cells/mL，接种于预涂未涂层的培养皿中。

3. 置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每2天更换新鲜培养基，倒置显微镜下观察细胞贴壁及悬浮或半贴壁生长，圆形或椭圆形，折光性强。