大鼠股骨头微血管内皮细胞

大鼠股骨头微血管内皮细胞

以Wistar大鼠股骨头微血管组织为材料，采用酶消化联合梯度离心分离内皮细胞，经胰蛋白酶-EDTA消化后传代，使用RPMI-1640培养基维持细胞生长；运用划痕愈合实验检测CD31的细胞表面/胞内表达，通过数字PCR(dPCR)分析蛋白表达谱，并结合钙成像探究相关信号通路。 传代培养4代后细胞仍保持良好增殖能力。

产品名称：大鼠股骨头微血管内皮细胞

英文名称： Rat Femoral Head Microvascular Endothelial Cells

组织来源： 股骨头组织

默认种属 ：大鼠

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的大鼠股骨头微血管内皮细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠股骨头微血管内皮细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 大鼠股骨头微血管内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠股骨头微血管内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 手术剪、镊子、培养耗材高压灭菌；超净台紫外通风30min。

2. 配制灌洗液 冰预冷D-Hanks液、消化液（Ⅰ型胶原酶+胶原酶Ⅱ）+透明质酸酶、DMEM/F12 + 20% FBS + 50μg/mL 肝素 + 1% 双抗、双抗。

3. SPF级SD大鼠（200-250g），10%水合氯醛腹腔注射麻醉，冰浴预冷所有缓冲液。

二、取材与预处理

1. 颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡消毒体表，无菌操作下暴露并摘取骨骼。

2. 置于冰预冷D-Hanks液中反复漂洗，去除血污及附属组织，仔细剔除结缔组织。

3. 将纯化后的骨骼组织用眼科剪尽量剪碎，尽量减小组织块大小以利消化。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块与Ⅰ型胶原酶+胶原酶Ⅱ+透明质酸酶混合酶液按1:3比例混合，37℃振荡消化41min。

2. 加入含20% FBS的培养基中和酶活性，反复吹打使组织充分分散。

3. 细胞悬液经40μm滤网过滤，2次200g×10min离心洗涤，收集细胞。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经40μm滤网过滤，采用Percoll密度梯度离心纯化内皮细胞，去除未消化组织块。

2. 用DMEM/F12 + 20% FBS + 50μg/mL 肝素 + 1% 双抗调整细胞浓度至110000.0cells/mL，接种于预涂胶原的培养皿中。

3. 置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每2-3天换液一次，倒置显微镜下观察细胞贴壁及鹅卵石样铺路石状排列，贴壁生长，细胞边界清晰。

动物取材须在无菌条件下进行，股骨头组织获取后迅速转入含抗生素的Hanks液中转运，组织离体时间超过1小时将严重影响股骨头微血管内皮的分离效率和活力。

实验前培养器皿需用0.5%明胶溶液包被1小时，PBS冲洗后晾干使用，该步骤对股骨头微血管内皮的贴壁和增殖至关重要。

该细胞贴壁生长，体外扩增能力有限，建议尽早进行功能实验，连续传代超过8次后细胞可能出现形态改变和标志物表达下调。

培养过程中需持续添加GM299培养基含20% FBS、5ng/ml VEGF和10ng/ml FGF以维持细胞最佳生长状态，抗生素浓度不宜过高以免影响细胞代谢活性，建议常规使用1% P/S即可。

每次换液前应观察细胞形态和密度，弃去旧培养基时动作轻柔沿壁缓慢吸除，避免扰动贴壁细胞层，新培养基预热至37°C后使用。