大鼠瘢痕疙瘩成纤维细胞

大鼠瘢痕疙瘩成纤维细胞

从SD大鼠的瘢痕疙瘩组织中分离纯化成纤维细胞，采用免疫荧光分选获得高纯度细胞群体，在含10% FBS的DMEM下扩增培养；运用慢病毒转染检测Thy-1, PDGFRβ标志物表达，通过生物膜干涉技术(Biacore)分析蛋白表达谱，并结合蛋白质组学(质谱)综合评价细胞表型特征。

产品名称：大鼠瘢痕疙瘩成纤维细胞

英文名称： Rat Keloid Fibroblasts

组织来源： 皮肤组织

默认种属 ：大鼠

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的大鼠瘢痕疙瘩成纤维细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠瘢痕疙瘩成纤维细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 大鼠瘢痕疙瘩成纤维细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:3

传代特性： 可传5-8代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠瘢痕疙瘩成纤维细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 准备无菌手术器械（手术剪、镊子、眼科剪）、培养耗材，高压灭菌后备用；超净工作台紫外消毒。

2. 提前配制冰预冷D-Hanks液、消化液（Ⅰ型胶原酶、Dispase II）、胰蛋白酶、DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗（37℃预热）、双抗溶液。

3. SPF级SD大鼠（200-250g），10%水合氯醛腹腔注射麻醉，所有试剂冰浴预冷备用。

二、取材与预处理

1. 颈椎脱臼处死，碘伏消毒术野，无菌操作取出皮肤组织。

2. 浸入冰预冷D-Hanks液中冲洗干净，仔细分离去除血管、神经及结缔组织。

3. 将组织转移至新的培养皿中，用手术剪精细剪碎成细小碎块。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块加入Ⅰ型胶原酶+Dispase II混合消化液，37℃消化36min，间断吹打。

2. 加入含10% FBS的培养基终止消化，吹打制备单细胞悬液。

3. 200g离心10min收集细胞沉淀，PBS重悬洗涤两遍。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液过40μm细胞滤网，采用差速贴壁法去除杂质细胞，去除团块和未消化组织。

2. 沉淀细胞用DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗重悬，台盼蓝染色检测活力（应>90%），以60000.0-210000.0cells/cm²密度接种。

3. 放入37℃、5% CO2恒温培养箱，每2-3天换液一次，镜检观察长梭形或纺锤形，贴壁生长，细胞核大而圆，核仁明显及生长状态。

取材操作全程在超净台中进行，瘢痕疙瘩组织取出后尽快去除血管和结缔组织，用含1% P/S的PBS清洗至组织变白，整个过程温度控制在4°C。

实验用培养皿应提前用0.01%聚鸟氨酸室温孵育2小时，PBS洗涤后风干，该预处理对瘢痕疙瘩成纤维的初始贴附具有决定性作用。

该细胞贴壁生长，每2-3天换液一次，传代比例为1:2至1:3，过度传代(>P5)会导致细胞衰老和功能性下降。

培养体系中必须补充DMEM/F12含10% FBS和1%青霉素-链霉素，生长因子浓度需严格按照方案配制，浓度过高可能导致细胞异常分化，浓度过低则细胞增殖受限。

每次换液前应观察细胞形态和密度，弃去旧培养基时动作轻柔沿壁缓慢吸除，避免扰动贴壁细胞层，新培养基预热至37°C后使用。