大鼠羊膜间充质干细胞

大鼠羊膜间充质干细胞

从SD大鼠的羊膜组织中分离纯化间充质干细胞，采用密度梯度离心法获得高纯度细胞群体，在含血清的基础培养基下扩增培养；运用划痕愈合实验检测CD34, TRA-1-60标志物表达，通过Matrigel侵袭实验分析蛋白表达谱，并结合细胞免疫荧光综合评价细胞表型特征。

产品名称：大鼠羊膜间充质干细胞

英文名称： Rat Amniotic Mesenchymal Stem Cells

组织来源： 羊膜组织

默认种属 ：大鼠

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的大鼠羊膜间充质干细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠羊膜间充质干细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 大鼠羊膜间充质干细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:3

传代特性： 可传10代以上

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠羊膜间充质干细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 手术剪、镊子、培养耗材高压灭菌；超净台紫外通风30min。

2. 配制灌洗液 冰预冷D-Hanks液、消化液（胶原酶Ⅳ、透明质酸酶、胰蛋白酶）、α-MEM + 10% FBS + 1% 双抗、双抗。

3. SPF级SD大鼠（200-250g），10%水合氯醛腹腔注射麻醉，冰浴预冷所有缓冲液。

二、取材与预处理

1. 颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡消毒体表，无菌操作下暴露并摘取胎盘。

2. 置于冰预冷D-Hanks液中反复漂洗，去除血污及附属组织，仔细剔除结缔组织。

3. 将纯化后的胎盘组织用眼科剪尽量剪碎，尽量减小组织块大小以利消化。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块与胶原酶Ⅳ+透明质酸酶+胰蛋白酶混合酶液按1:3比例混合，37℃振荡消化38min。

2. 加入含20% FBS的培养基中和酶活性，反复吹打使组织充分分散。

3. 细胞悬液经40μm滤网过滤，1次200g×10min离心洗涤，收集细胞。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经40μm滤网过滤，采用Percoll密度梯度离心富集干细胞，去除未消化组织块。

2. 用α-MEM + 10% FBS + 1% 双抗调整细胞浓度至130000.0cells/mL，接种于预涂明胶的培养皿中。

3. 置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每2天换液一次，倒置显微镜下观察细胞贴壁及梭形或多角形，贴壁生长，核质比高，核仁明显。

取材时必须在冰上低温操作，30分钟内完成间充质组织的分离与纯化处理，室温暴露时间过长会直接导致细胞活性下降40%以上。

培养器皿提前用0.1mg/ml纤连蛋白包被过夜，4°C保存，使用前用PBS洗涤2次，该处理可显著促进羊膜间充质干的贴壁生长。

该细胞属于贴壁依赖性细胞，体外增殖速度适中，建议每3天更换一次培养基，传代时按1:3比例操作，避免过度融合导致接触抑制。

培养基中应加入MEM-α含10% FBS、1% P/S和5ng/ml bFGF，使用前需预热至37°C并预平衡CO2浓度至5%，血清批次更换前需进行预实验验证促生长效果。

每次换液前应观察细胞形态和密度，弃去旧培养基时动作轻柔沿壁缓慢吸除，避免扰动贴壁细胞层，新培养基预热至37°C后使用。