大鼠胚肝间充质干细胞

方法简介  实验室分离的大鼠胚肝间充质干细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠胚肝间充质干细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 大鼠胚肝间充质干细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:3

传代特性： 可传10代以上

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠胚肝间充质干细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：6-8周龄雄性SD大鼠，体重190-230g，单只取材可得0.9-1.6×10⁶个目标细胞，活率>92%

试剂：0.125%胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、DNase I、透明质酸酶、RPMI-1640培养基

分离纯化步骤

组织块经Hanks液反复冲洗后剪碎，加入0.125%胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、DNase I、透明质酸酶于37℃水浴消化40-60分钟，期间间歇振荡

滤过100目滤网后的细胞悬液加入等体积含10% FBS的培养基终止消化，600g离心8分钟

采用预混合抗体标记+磁珠分选策略，特异性富集目标细胞，纯度>85%

原代培养要点

调整细胞浓度至5×10⁴，接种于胶原/纤维连接蛋白包被的培养皿中，37℃、5% CO₂培养

原代干细胞贴壁效率较低，建议适当提高接种密度以保证存活率

常见问题优化

细胞活力差：严格控制消化时间，除消化步骤外全程冰上操作，使用新鲜配制试剂

纯度不达标：优化密度梯度离心条件，延长免疫磁珠孵育时间，增加洗涤步骤

细胞贴壁率低：使用合适包被基质（胶原/纤维连接蛋白/多聚赖氨酸），优化接种密度

一、实验前准备

1. 准备无菌手术器械（手术剪、镊子、眼科剪）、培养耗材，高压灭菌后备用；超净工作台紫外消毒。

2. 提前配制冰预冷D-Hanks液、消化液（胶原酶Ⅳ、透明质酸酶）、胰蛋白酶、α-MEM + 10% FBS + 1% 双抗（37℃预热）、双抗溶液。

3. SPF级SD大鼠（200-250g），10%水合氯醛腹腔注射麻醉，所有试剂冰浴预冷备用。

二、取材与预处理

1. 颈椎脱臼处死，碘伏消毒术野，无菌操作取出肝脏组织。

2. 浸入冰预冷D-Hanks液中冲洗干净，仔细分离去除血管、神经及结缔组织。

3. 将组织转移至新的培养皿中，用手术剪精细剪碎成细小碎块。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块加入胶原酶Ⅳ+透明质酸酶混合消化液，37℃消化42min，间断吹打。

2. 加入含10% FBS的培养基终止消化，吹打制备单细胞悬液。

3. 200g离心10min收集细胞沉淀，PBS重悬洗涤两遍。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液过40μm细胞滤网，采用Percoll密度梯度离心富集干细胞，去除团块和未消化组织。

2. 沉淀细胞用α-MEM + 10% FBS + 1% 双抗重悬，台盼蓝染色检测活力（应>90%），以60000.0-220000.0cells/cm²密度接种。

3. 放入37℃、5% CO2恒温培养箱，每2天换液一次，镜检观察梭形或多角形，贴壁生长，核质比高，核仁明显及生长状态。