骨粘连蛋白(ON)ELISA试剂盒

骨粘连蛋白(ON)ELISA试剂盒

试剂盒预先包被骨粘连蛋白(ON)捕获抗体的微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤后，用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化为蓝色，在酸的作用下最终转化为黄色，颜色深浅与样本中osteonectin，ON的含量呈正相关。

1、血清：室温血液自然凝固10-20分钟，2000-3000转/分离心20分钟收集上清。

2、血浆：用EDTA或柠檬酸钠抗凝，混匀10-20分钟后2000-3000转/分离心20分钟取上清。

3、组织标本：称重后加pH7.4的PBS匀浆，液氮速冻后融化，2000-3000转/分离心20分钟取上清。

4、样本采集后24小时内完成检测，暂不检测可分装-20℃冻存，避免反复冻融。

操作步骤：

1、所有试剂提前从冰箱取出，平衡至室温后再使用，浓洗涤液盐析出时可37℃水浴助溶稀释。

2、设置标准品孔、待测样本孔，每孔分别加入梯度标准品或处理好的待测样本100μL，37℃孵育90分钟。

3、弃去孔内液体，不用洗涤，直接加入新鲜稀释的生物素化抗体工作液100μL，37℃孵育60分钟。

4、弃去液体后洗板3次，每次浸泡1-2分钟，拍干后加入酶结合物工作液100μL，37℃避光孵育30分钟。

5、弃去液体后洗板5次，每孔加入底物溶液90μL，37℃避光孵育10-20分钟，可见孔内出现蓝色梯度。

6、每孔快速加入终止液50μL，颜色由蓝立即转为黄色，15分钟内用酶标仪在450nm波长读取OD值。

一、全程避免样本溶血：红细胞破裂释放的内源性过氧化物酶，会直接干扰HRP标记抗体的酶促反应，引发非特异性显色，导致结果虚高。

二、样本避免反复冻融：反复冻融导致蛋白降解、聚合，破坏抗原的天然构象，无法被包被抗体和检测抗体识别，定量结果大幅偏低。

不同批号试剂严禁混用：不同批次的捕获抗体、酶标抗体效价存在差异，混用会打破“三明治”免疫复合物的结合比例，直接破坏标准曲线的线性关系。

温育条件严格统一：所有反应孔的温育时间、温度必须完全一致，37℃环境下精准控制孵育时长，避免免疫结合效率不均，导致孔间结果偏差。