大鼠颅盖造骨细胞

大鼠颅盖造骨细胞

以Wistar大鼠为实验来源，经胶原酶消化法处理颅盖组织后，通过MACS分选纯化获得造骨，采用含INS/FGF的基础培养基培养；通过ATAC-seq检测vimentin阳性率，膜片钳技术定量CD90表达量，结合透射电镜(TEM)综合评价细胞表型。

产品名称：大鼠颅盖造骨细胞

英文名称： Rat Calvarial Osteoblasts

组织来源： 颅盖骨组织

默认种属 ：大鼠

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的大鼠颅盖造骨细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的大鼠颅盖造骨细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 大鼠颅盖造骨细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 多边形

传代比例： 1:3

传代特性： 可传5-8代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

大鼠颅盖造骨细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 手术剪、镊子、培养耗材高压灭菌；超净台紫外通风30min。

2. 配制灌洗液 冰预冷D-Hanks液、消化液（Ⅰ型胶原酶+胶原酶Ⅱ）+透明质酸酶、α-MEM + 10% FBS + 1% 双抗 + 50μg/mL 抗坏血酸、双抗。

3. SPF级SD大鼠（200-250g），10%水合氯醛腹腔注射麻醉，冰浴预冷所有缓冲液。

二、取材与预处理

1. 颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡消毒体表，无菌操作下暴露并摘取骨骼。

2. 置于冰预冷D-Hanks液中反复漂洗，去除血污及附属组织，仔细剔除结缔组织。

3. 将纯化后的骨骼组织用眼科剪尽量剪碎，尽量减小组织块大小以利消化。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块与Ⅰ型胶原酶+胶原酶Ⅱ+透明质酸酶混合酶液按1:3比例混合，37℃振荡消化44min。

2. 加入含20% FBS的培养基中和酶活性，反复吹打使组织充分分散。

3. 细胞悬液经40μm滤网过滤，1次200g×10min离心洗涤，收集细胞。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经40μm滤网过滤，采用适当纯化方法去除杂质细胞，去除未消化组织块。

2. 用α-MEM + 10% FBS + 1% 双抗 + 50μg/mL 抗坏血酸调整细胞浓度至140000.0cells/mL，接种于预涂明胶的培养皿中。

3. 置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每3天换液一次，倒置显微镜下观察细胞贴壁及多角形或梭形，贴壁生长，可观察到矿化结节。

取材前动物需禁食12小时，颈椎脱臼法处死后立即取骨组织，置于预冷的PBS中运输至实验室，从取材到开始消化处理不超过20分钟。

实验前培养器皿需用0.5%明胶溶液包被1小时，PBS冲洗后晾干使用，该步骤对颅盖造骨的贴壁和增殖至关重要。

该细胞具有贴壁生长特性，培养过程中需维持培养基pH在7.2-7.4之间，每2天更换新鲜培养基，传代时采用0.25%胰蛋白酶消化。

培养基中必须含有α-MEM含10% FBS、1% P/S、50μg/ml维生素C和10mM β-甘油磷酸钠，其中重组生长因子需分装保存于-80°C避免反复冻融，每次使用新鲜稀释至工作浓度以保证实验可重复性。

换液前先用倒置显微镜观察细胞贴壁情况和形态特征，确认无污染后缓慢吸除旧培养基，沿壁缓慢加入预热的新鲜培养基，避免直接冲洗细胞层。