人口腔角质形成细胞

人口腔角质形成细胞

实验选用伦理批准的人源组织，取材后迅速转移至预冷的PBS缓冲液中，经中性蛋白酶+胶原酶IV消化获取原代角质形成细胞，接种后置于37°C、5% CO2培养箱中，采用含血清的基础培养基维持培养，每3天换液一次；细胞鉴定采用蛋白质印迹检测Keratin 5阳性表达率，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)定量Involucrin表达量，结合间接免疫荧光分析下游通路蛋白表达变化，并通过划痕愈合实验验证细胞生物学活性。

产品名称：人口腔角质形成细胞

英文名称： Human Oral Keratinocytes

组织来源： 口腔组织

默认种属 ：人

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的人口腔角质形成细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的人口腔角质形成细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 人口腔角质形成细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 上皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

人口腔角质形成细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 准备无菌手术器械（手术剪、镊子、眼科剪）、培养耗材，高压灭菌后备用；超净工作台紫外消毒。

2. 提前配制冰预冷PBS缓冲液、消化液（Ⅰ型胶原酶、Dispase II）、胰蛋白酶、K-SFM培养基 + EGF + BSA（37℃预热）、双抗溶液。

3. 人源组织样本（临床手术废弃组织），所有试剂冰浴预冷备用。

二、取材与预处理

1. 经伦理委员会批准获取，碘伏消毒术野，无菌操作取出口腔组织。

2. 浸入冰预冷PBS缓冲液中冲洗干净，仔细分离去除血管、神经及结缔组织。

3. 将组织转移至新的培养皿中，用手术剪精细剪碎成细小碎块。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块加入Ⅰ型胶原酶+Dispase II混合消化液，37℃消化48min，间断吹打。

2. 加入含10% FBS的培养基终止消化，吹打制备单细胞悬液。

3. 200g离心10min收集细胞沉淀，PBS重悬洗涤两遍。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液过40μm细胞滤网，采用适当纯化方法去除杂质细胞，去除团块和未消化组织。

2. 沉淀细胞用K-SFM培养基 + EGF + BSA重悬，台盼蓝染色检测活力（应>90%），以60000.0-230000.0cells/cm²密度接种。

3. 放入37℃、5% CO2恒温培养箱，每2天换液一次，镜检观察多角形或铺路石样排列，贴壁生长，细胞间紧密连接及生长状态。

取材时必须在冰上低温操作，30分钟内完成口腔黏膜组织的分离与纯化处理，室温暴露时间过长会直接导致细胞活性下降40%以上。

实验用培养皿应提前用0.01%聚鸟氨酸室温孵育2小时，PBS洗涤后风干，该预处理对腔角质形成的初始贴附具有决定性作用。

该细胞贴壁生长，体外扩增能力有限，建议尽早进行功能实验，连续传代超过8次后细胞可能出现形态改变和标志物表达下调。

培养过程中需持续添加K-SFM培养基含0.05mg/ml BSA和5μg/ml胰岛素以维持细胞最佳生长状态，抗生素浓度不宜过高以免影响细胞代谢活性，建议常规使用1% P/S即可。

日常维护中需每日检查细胞形态和培养基颜色，出现浑浊或颜色异常应立即换液并排查污染，传代后24小时内避免换液以利于细胞贴附恢复。