人骨髓树突状细胞(未成熟DC细胞)

人骨髓树突状细胞(未成熟DC细胞)

实验选用健康成人供体，取材后迅速转移至预冷的PBS缓冲液中，经胶原酶I/II联合消化获取原代未成熟DC细胞，接种后置于37°C、5% CO2培养箱中，采用专用培养液维持培养，每3天换液一次；细胞鉴定采用透射电镜(TEM)检测CD90阳性表达率，钙成像定量SSEA-1表达量，结合数字PCR(dPCR)分析下游通路蛋白表达变化，并通过自噬流检测验证细胞生物学活性。

产品名称：人骨髓树突状细胞(未成熟DC细胞)

英文名称： Human Bone Marrow-derived Immature Dendritic Cells

组织来源： 骨髓组织

默认种属 ：人

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的人骨髓树突状细胞(未成熟DC细胞)采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的人骨髓树突状细胞(未成熟DC细胞)经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 人骨髓树突状细胞(未成熟DC细胞)完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 未分化

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

人骨髓树突状细胞(未成熟DC细胞)体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 准备无菌手术器械（手术剪、镊子、眼科剪）、培养耗材，高压灭菌后备用；超净工作台紫外消毒。

2. 提前配制冰预冷PBS缓冲液、消化液（RICAM、淋巴细胞分离液）、NH4Cl、RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 双抗 + 50μM β-ME（37℃预热）、双抗溶液。

3. 人源组织样本（临床手术废弃组织），所有试剂冰浴预冷备用。

二、取材与预处理

1. 经伦理委员会批准获取，碘伏消毒术野，无菌操作取出骨髓组织。

2. 浸入冰预冷PBS缓冲液中冲洗干净，仔细分离去除血管、神经及结缔组织。

3. 将组织转移至新的培养皿中，用手术剪精细剪碎成细小碎块。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块加入RICAM+淋巴细胞分离液混合消化液，37℃消化44min，间断吹打。

2. 加入含10% FBS的培养基终止消化，吹打制备单细胞悬液。

3. 200g离心10min收集细胞沉淀，PBS重悬洗涤两遍。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液过200μm细胞滤网，采用Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞，去除团块和未消化组织。

2. 沉淀细胞用RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 双抗 + 50μM β-ME重悬，台盼蓝染色检测活力（应>90%），以60000.0-240000.0cells/cm²密度接种。

3. 放入37℃、5% CO2恒温培养箱，每2天更换新鲜培养基，镜检观察悬浮或半贴壁生长，圆形或椭圆形，折光性强及生长状态。

取材操作全程在超净台中进行，骨组织取出后尽快去除血管和结缔组织，用含1% P/S的PBS清洗至组织变白，整个过程温度控制在4°C。

培养皿需用胶原蛋白-I型(5μg/cm2)包被过夜，次日PBS洗涤3次后使用，未包被表面髓树突状(未成熟DC)难以正常贴附和铺展。

该细胞贴壁生长，增殖较为缓慢，每3-4天换液一次，传代比例建议1:2至1:4，长期培养需注意细胞衰老标记物的检测。

培养基中需添加RPMI-1640含10% FBS、20ng/ml IL-4和20ng/ml GM-CSF，其中血清浓度应根据细胞生长状态适当调整，低血清条件有助于减少杂细胞污染但可能影响髓树突状(未成熟DC)增殖速度。

换液操作全程注意无菌操作，使用经0.22μm滤膜过滤的新鲜培养基，加入后轻摇培养皿使培养基均匀分布，避免产生气泡影响细胞生长。