人口腔黏膜成纤维细胞

人口腔黏膜成纤维细胞

实验选用伦理批准的人源组织，取材后迅速转移至预冷的PBS缓冲液中，经胰蛋白酶-EDTA消化联合密度梯度离心获取原代成纤维细胞，接种后置于37°C、5% CO2培养箱中，采用含EGF/INS的完全培养基维持培养，每3天换液一次；细胞鉴定采用co-IP检测PDGFRβ阳性表达率，膜片钳技术定量PDGFR-α表达量，结合FRET生物传感器分析下游通路蛋白表达变化，并通过氧化应激实验验证细胞生物学活性。

产品名称：人口腔黏膜成纤维细胞

英文名称： Human Oral Mucosal Fibroblasts（同第 8 条，仅 “黏膜” 写法差异）

组织来源： 口腔组织

默认种属 ：人

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的人口腔黏膜成纤维细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的人口腔黏膜成纤维细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 人口腔黏膜成纤维细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:3

传代特性： 可传5-8代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

人口腔黏膜成纤维细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 准备无菌手术器械（手术剪、镊子、眼科剪）、培养耗材，高压灭菌后备用；超净工作台紫外消毒。

2. 提前配制冰预冷PBS缓冲液、消化液（Ⅰ型胶原酶、Dispase II）、胰蛋白酶、K-SFM培养基 + EGF + BSA（37℃预热）、双抗溶液。

3. 人源组织样本（临床手术废弃组织），所有试剂冰浴预冷备用。

二、取材与预处理

1. 经伦理委员会批准获取，碘伏消毒术野，无菌操作取出口腔组织。

2. 浸入冰预冷PBS缓冲液中冲洗干净，仔细分离去除血管、神经及结缔组织。

3. 将组织转移至新的培养皿中，用手术剪精细剪碎成细小碎块。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块加入Ⅰ型胶原酶+Dispase II混合消化液，37℃消化41min，间断吹打。

2. 加入含10% FBS的培养基终止消化，吹打制备单细胞悬液。

3. 200g离心10min收集细胞沉淀，PBS重悬洗涤两遍。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液过40μm细胞滤网，采用适当纯化方法去除杂质细胞，去除团块和未消化组织。

2. 沉淀细胞用K-SFM培养基 + EGF + BSA重悬，台盼蓝染色检测活力（应>90%），以60000.0-210000.0cells/cm²密度接种。

3. 放入37℃、5% CO2恒温培养箱，每2天换液一次，镜检观察多角形或铺路石样排列，贴壁生长，细胞间紧密连接及生长状态。

取材前动物需禁食12小时，手术切除法处死后立即取口腔黏膜组织，置于预冷的PBS中运输至实验室，从取材到开始消化处理不超过20分钟。

培养板需提前用0.01%多聚赖氨酸包被2小时，使用前PBS洗涤3次，未处理的培养表面会导致腔黏膜成纤维贴壁不良和形态异常。

该细胞为贴壁型细胞，体外培养条件下可稳定增殖，建议每2-3天换液，传代比例1:3，培养温度严格控制在37°C。

培养基中必须含有DMEM/F12含10% FBS和1%青霉素-链霉素，其中重组生长因子需分装保存于-80°C避免反复冻融，每次使用新鲜稀释至工作浓度以保证实验可重复性。

换液前先用倒置显微镜观察细胞贴壁情况和形态特征，确认无污染后缓慢吸除旧培养基，沿壁缓慢加入预热的新鲜培养基，避免直接冲洗细胞层。