人子宫内膜间质细胞

方法简介  实验室分离的人子宫内膜间质细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的人子宫内膜间质细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 人子宫内膜间质细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:3

传代特性： 可传5-8代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

人子宫内膜间质细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：健康志愿者供体组织（经医院伦理委员会批准），每例取材获0.8-2.5×10⁶个细胞，活力>90%

试剂：0.1%胰蛋白酶、Ⅰ型/Ⅳ型胶原酶混合液、DNase I、BSA、RPMI-1640培养基

分离纯化步骤

取目标组织用无钙镁PBS洗涤3次，剔除脂肪和结缔组织后剪成小碎片，加入0.1%胰蛋白酶、Ⅰ型/Ⅳ型胶原酶混合液、DNase I、BSA消化45-90分钟

消化液经100目不锈钢滤网过滤，收集滤液，4℃、400g离心10分钟收集细胞沉淀

利用免疫磁珠分选技术（MACS）纯化目标细胞，纯度可达87%以上

原代培养要点

细胞重悬于完全培养基中，按3×10⁴密度接种，置于37℃、5% CO₂恒温培养箱

细胞贴壁生长，形态均匀，24-48小时内可见明显贴壁现象，第3-5天可达80-90%融合

常见问题优化

细胞贴壁率低：使用合适包被基质（胶原/纤维连接蛋白/多聚赖氨酸），优化接种密度

纯度不达标：优化密度梯度离心条件，延长免疫磁珠孵育时间，增加洗涤步骤

细胞生长缓慢：检查血清批次质量，补充必要生长因子，确保CO₂浓度和温度稳定

一、实验前准备

1. 准备无菌手术器械（手术剪、镊子、眼科剪）、培养耗材，高压灭菌后备用；超净工作台紫外消毒。

2. 提前配制冰预冷PBS缓冲液、消化液（Ⅳ型胶原酶、胶原酶Ⅰ）、透明质酸酶、DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗（37℃预热）、双抗溶液。

3. 人源组织样本（临床手术废弃组织），所有试剂冰浴预冷备用。

二、取材与预处理

1. 经伦理委员会批准获取，碘伏消毒术野，无菌操作取出子宫组织。

2. 浸入冰预冷PBS缓冲液中冲洗干净，仔细分离去除血管、神经及结缔组织。

3. 将组织转移至新的培养皿中，用手术剪精细剪碎成细小碎块。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块加入Ⅳ型胶原酶+胶原酶Ⅰ混合消化液，37℃消化47min，间断吹打。

2. 加入含10% FBS的培养基终止消化，吹打制备单细胞悬液。

3. 200g离心10min收集细胞沉淀，PBS重悬洗涤两遍。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液过40μm细胞滤网，采用适当纯化方法去除杂质细胞，去除团块和未消化组织。

2. 沉淀细胞用DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗重悬，台盼蓝染色检测活力（应>90%），以60000.0-220000.0cells/cm²密度接种。

3. 放入37℃、5% CO2恒温培养箱，每2-3天换液一次，镜检观察长梭形或纺锤形，贴壁生长，呈旋涡状排列及生长状态。