人退行性椎间盘髓核细胞

方法简介  实验室分离的人退行性椎间盘髓核细胞采用胶原酶-中性蛋白酶联合消化结合差速贴壁法，并通过专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的人退行性椎间盘髓核细胞经特异性标志物免疫荧光鉴定，纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 人退行性椎间盘髓核细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 多边形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3-5代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

人退行性椎间盘髓核细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：健康志愿者供体组织（经医院伦理委员会批准），每例取材获0.8-2.5×10⁶个细胞，活力>90%

试剂：中性蛋白酶、胶原酶D、透明质酸酶、FBS、MEM/F12培养基

分离纯化步骤

取材组织经PBS清洗去除血液和杂质，剪碎至1mm³大小，加入中性蛋白酶、胶原酶D、透明质酸酶、FBS于37℃振荡消化180-360分钟

消化液经100目不锈钢滤网过滤，收集滤液，4℃、400g离心12分钟收集细胞沉淀

细胞沉淀重悬于含10% FBS的培养基中，经Ficoll密度梯度离心（400g，12分钟）纯化目标细胞

原代培养要点

调整细胞密度至2×10⁴接种于预处理培养皿，37℃、5% CO₂培养箱培养

细胞呈圆形或椭圆形，SOX9表达阳性，培养过程中添加TGF-β3维持分化状态

常见问题优化

细胞形态异常：检查培养基pH值和渗透压，避免过度传代导致细胞老化

培养过程中出现污染：严格无菌操作，培养基中添加适量抗生素，定期检测支原体

目标细胞占比低：优化消化条件提高目标细胞得率，改进分离策略减少非目标细胞污染

一、实验前准备

1. 手术剪、镊子、培养耗材高压灭菌；超净台紫外通风30min。

2. 配制灌洗液 冰预冷PBS缓冲液、消化液（胶原酶Ⅰ+胶原酶Ⅱ）、DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗、双抗。

3. 人源组织样本（临床手术废弃组织），冰浴预冷所有缓冲液。

二、取材与预处理

1. 经伦理委员会批准获取，75%酒精浸泡消毒体表，无菌操作下暴露并摘取椎间盘。

2. 置于冰预冷PBS缓冲液中反复漂洗，去除血污及附属组织，仔细剔除结缔组织。

3. 将纯化后的椎间盘组织用眼科剪尽量剪碎，尽量减小组织块大小以利消化。

三、细胞分离与消化

1. 组织碎块与胶原酶Ⅰ+胶原酶Ⅱ混合酶液按1:3比例混合，37℃振荡消化44min。

2. 加入含20% FBS的培养基中和酶活性，反复吹打使组织充分分散。

3. 细胞悬液经40μm滤网过滤，2次200g×10min离心洗涤，收集细胞。

四、纯化与接种培养

1. 细胞悬液经40μm滤网过滤，采用适当纯化方法去除杂质细胞，去除未消化组织块。

2. 用DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 双抗调整细胞浓度至140000.0cells/mL，接种于预涂明胶的培养皿中。

3. 置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每2-3天换液一次，倒置显微镜下观察细胞贴壁及形态因细胞类型而异，贴壁或悬浮生长。