以药找靶：化学蛋白质组学（ABPP）实验服务

摘要：与细胞内蛋白质靶点的相互作用是天然产物发挥药理活性的基础。因此，靶点识别是发现和开发新天然药物的关键步骤。本文介绍了以药找靶技术ABPP（化学蛋白质组学）的原理和基本实验流程。

一、ABPP技术介绍

ABPP是一种先进的化学蛋白质组学策略。它巧妙地结合了基于活性的探针（Activity-Based Probes, ABPs）和高通量的蛋白质组学技术，旨在识别和鉴定活性小分子的蛋白质靶标。ABPP技术的核心在于利用经过精心设计和改造的小分子探针作为“诱饵”，特异性地捕获并标记与活性小分子发生相互作用的靶点蛋白质。随后，通过高效的富集和鉴定流程，深入阐明活性小分子发挥作用的分子机制。

基于ABPP技术的靶蛋白垂钓技术可以分为以下三个步骤：

1. 活性分子探针设计合成及活性检测

2. 利用改造后的活性小分子垂钓靶蛋白并进行鉴定

3. 活性小分子与靶蛋白间的相互作用验证。

二、ABPP主要实验步骤（样本以细胞裂解液、光亲和探针为例）

探针制备：活性分子探针的设计合成，以及探针活性鉴定。

靶点鉴定：

1. 将探针与总蛋白孵育，使探针和靶点蛋白结合。

2. 上述孵育完成后，先后进行UV照射（使探针与靶蛋白共价相连）、 点击化学反应（给活性分子引入报告基团，如荧光基团），进行SDS-PAGE检测。

3. 根据预实验测试的探针用量进行正式实验，通过生物素对靶蛋白进行富集鉴定。

图2  ABPP实验基本流程图

三、案例介绍

基于ABPP技术的天然产物衍生物靶蛋白鉴定

 在前期的研究当中，作者从大果大戟的共生真菌中分离出了一种天然产物auxarthrol  A，在对其进行简单的结构修饰后，其修饰后产物（auxarthrol A 的 3,4-二异丁酰基衍生物，DAA）表现出了更强的NSCLC细胞系抑制活性。

为了寻找DAA的作用靶点，作者采取了ABPP的实验方法（图4a）：将探针与细胞孵育，然后进行紫外照射进行光交联，随后裂解细胞，进行点击化学反应从而生物素化，最后通过链霉亲和素琼脂糖珠进行富集鉴定。

通过质谱分析实验组、对照组和竞争组，发现LIC1蛋白被游离的DAA竞争。推测LIC1可能作为DAA的细胞靶点。后续通过SPR（图4g）、小分子pull down（图4d）、CETSA（图4e）和小分子免疫荧光（图4f）证明了二者的相互作用。

图3  本研究思维导图

图4  本研究活性探针结构、ABPP实验流程、相互作用验证

ABPP实验方法

Pull-down assays used the proteome labeling strategy, as previously described19. In brief, cell lysates were incubated with a freshly prepared click chemistry cocktail containing 100?μM TBTA, 1?mM CuSO4, 10?mM sodium ascorbate and 100?μM biotin-PEG4-N3. Following a 3-h reaction at room temperature with vigorous shaking, proteins were precipitated by adding prechilled acetone. Precipitated proteins were isolated, resuspended in 1% SDS in PBS and then affinity-purified using streptavidin agarose beads to isolate biotin-labeled binding partners. Beads were washed sequentially with 1% SDS in PBS (×1), 0.1% SDS in PBS (×2) and PBS (×2). Enriched proteins were resolved on 10% SDS–PAGE and detected using Coomassie blue staining. All corresponding bands were excised and subjected to in-gel digestion before nanoLC–MS/MS analysis on a Q Exactive Plus instrument (Thermo Fisher Scientific). The salt removal assays and parameter settings referred to the manufacturer’s instructions. Raw files were processed by Proteome Discoverer 2.2.0 (Thermo Fisher Scientific) against the Homo sapiens proteome using default parameters, with common contaminants and serum proteins included in FASTA format.

参考文献：

Huang JL, Wu LM, Wu SQ, Yuan FY, Weng HZ, Huang D, Gan L, Chen SB, Tang GH, Yin S. A small molecule targets LIC1 to suppress lung tumor growth by inducing autophagy. Nat Chem Biol. 2025 Oct 16. doi: 10.1038/s41589-025-02040-w. Epub ahead of print. PMID: 41102409.

ABPP样品准备要求：

1、送样形式以细胞沉淀或者提取的总蛋白溶液

2、探针2-3mg，原料药5mg，冰袋寄送即可，也可与细胞或蛋白样品一起寄送

3、细胞沉淀需要6×10⁷及以上，沉淀经PBS清洗三次，去除残留PBS，以沉淀形式寄送

4、总蛋白浓度4mg/ml及以上，不少于4ml（注：所用裂解液必须为弱裂解液，需要保持蛋白活性，蛋白酶抑制剂需使用质谱兼容型）

5、细胞及蛋白样品使用干冰寄送，干冰用量5kg/天（即快递需要1天，使用5kg干冰；2天使用10kg干冰，依次类推）

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