猪主动脉内皮细胞

猪主动脉内皮细胞

从迷你猪主动脉内皮细胞组织标本经胶原酶-弹性蛋白酶联合消化获取单细胞悬液，通过 Percoll 密度梯度离心纯化内皮细胞组分，接种于纤维连接蛋白预包被的培养皿中，使用内皮基础培养基 supplemented with 多种生长因子（VEGF、FGF-2、IGF-1 及 Ascorbic acid）维持培养；通过免疫荧光染色显示 CD31 膜染色阳性、vWF 胞质颗粒状表达，并结合乙酰化 LDL 荧光摄取实验和内皮管腔形成 assay 综合鉴定。

产品名称：猪主动脉内皮细胞

英文名称： Porcine Aortic Endothelial Cells

组织来源： 胸主动脉组织

默认种属 ：小香猪

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的猪主动脉内皮细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法、并通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的猪主动脉内皮细胞经CD31免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基： 猪主动脉内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

猪主动脉内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 试剂：M199 完全培养基（20% FBS+1% 青链霉素 + ECGS）、PBS、0.1%Ⅰ 型胶原酶、75% 酒精、肝素生理盐水。

2. 耗材器械：无菌手术器械、15mL 离心管、培养皿、细胞培养瓶、止血钳、动脉夹持钳、封口针管。

3. 准备新鲜离体猪胸主动脉，取材后低温转运，全程无菌操作。

二、取材与预处理

1. 屠宰后立即取胸主动脉，剔除外层脂肪与结缔组织，肝素生理盐水反复冲洗血管内腔冲净残血。

2. 血管两端用线结扎一端，另一端注入预冷 PBS 灌满血管腔，反复冲洗内腔 2~3 次，倒置沥干管内液体。

3. 血管外侧 75% 酒精擦拭消毒外壁，避免液体流入管腔损伤内皮单层。

三、细胞分离与消化

1. 向血管管腔内注入 0.1%Ⅰ 型胶原酶消化液，灌满后结扎另一端，37℃恒温水浴浸泡消化 15~20min。

2. 轻柔揉搓血管外壁促进内皮脱落，剪开结扎口，收集管内消化液，再用少量完全培养基冲洗血管内腔，合并全部液体。

3. 收集液体 1200r/min 离心 6min，弃上清，PBS 洗涤细胞沉淀 1 次。

四、纯化与接种培养

1. 完全培养基重悬细胞沉淀，接种于培养瓶，37℃培养箱静置培养。

2. 12h 后换液去除未贴壁细胞，后续每 2 天更换一次完全培养基；杂细胞极少，无需额外纯化。

3. 细胞铺满瓶底即可传代，CD31、vWF 因子鉴定内皮细胞，仅前 3 代细胞可用。

1. 原代 PAEC 非常脆弱：代次严格控制，P3 之后细胞功能下降，不建议用于内皮功能、NO、eNOS、剪切应力实验。

2. 包被是关键：未包被培养瓶，细胞贴壁差、容易脱落。

3. 避免成纤维细胞污染：污染后细胞形态杂乱，失去铺路石样，vWF/CD31 阳性率下降，建议弃用。

4. 不要使用普通基础培养基长期培养，必须添加内皮细胞生长添加剂，否则细胞增殖缓慢、快速老化。

5. 生物安全：属于动物源性原代细胞，操作全程遵守生物安全二级 BSL-2 规范，实验后充分灭活废液。