猪成骨细胞

猪成骨细胞

采用组织块贴壁法从迷你猪新生鼠颅骨或胫骨组织中分离成骨细胞，经 0.25% 胶原酶 II 和 0.1% 胰蛋白酶序贯消化 2-3 次后，将多次消化获得的细胞接种于 DMEM 低糖培养基（含 10% FBS、50 μg/mL 抗坏血酸磷酸盐和 10 mM β-甘油磷酸钠）中培养；通过碱性磷酸酶（ALP）染色检测早期成骨分化标志，Alizarin Red S 染色验证钙结节形成能力，免疫荧光检测 Runx2、Osterix、骨钙素（Osteocalcin）及 I 型胶原（Col-I）表达确认成骨细胞身份。

产品名称：猪成骨细胞

英文名称： Porcine Osteoblast Cells

组织来源： 颅骨组织

默认种属 ：猪

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的猪成骨细胞采用先用胰蛋白酶短时间消化、后用胶原酶反复消化制备而来。

质量检测  实验室分离的猪成骨细胞经ALP染色检测，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  猪成骨细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 梭形、多角形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

猪成骨细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

复苏前期试剂耗材准备：37℃水浴预热猪成骨细胞专用完全培养基，准备无菌离心管、T25 培养瓶、PBS 缓冲液、胰酶‑EDTA 消化液，超净台紫外灭菌 30min，核对冻存管标签；猪原代细胞对污染敏感，检查试剂无沉淀浑浊，确认培养箱 37℃、5% CO₂参数正常。

冻存细胞水浴解冻操作：从液氮罐取出冻存管，快速放入 37℃水浴，持续轻柔晃动冻存管，1‑2min 完成冻存液融化，仅剩微小冰晶，取出冻存管，75% 酒精擦拭外壁，移入超净工作台，缩短室温暴露时间。

稀释离心去除 DMSO 冻存保护剂：将管内细胞悬液缓慢滴加到装有预温完全培养基的 15mL 离心管，轻柔吹打混匀，900r/min 离心 6min，离心结束，小心弃去上层上清，充分去除 DMSO，保护底部细胞沉淀。

重悬单细胞悬液接种铺瓶：加入猪成骨细胞完全培养基，温和吹打细胞沉淀，制备均匀单细胞悬液，细胞计数后按照标准密度接种 T25 培养瓶，十字摇晃培养瓶，使细胞均匀分布瓶底。

培养箱静置孵育贴壁：平稳放入 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱静置孵育，24‑48h 内减少挪动培养瓶，成骨细胞需要充足时间完成贴壁伸展。

换液处理以及细胞观察：复苏 48h 后进行首次换液，吸弃旧培养基，清除悬浮死亡细胞，加入预热新鲜培养基；每 2‑3 天更换培养基，显微镜观察多边形、梭形成骨细胞形态，后期可观察钙结节形成，监控污染情况。

传代消化收集细胞：细胞汇合 70‑80% 开展传代，弃旧培养基，PBS 洗涤细胞，加入胰酶消化，镜下细胞收缩变圆，立刻加入完全培养基终止消化，收集细胞悬液离心，重悬分瓶扩增；原代猪成骨细胞传代次数有限，高代细胞成骨能力下降。

1.实验全程需在生物安全柜中操作，避免空气中的微生物污染培养体系。

2.使用Matrigel基质胶稀释后包被培养器皿，4度过夜后37度预热使用。

3.该细胞对培养条件较为敏感，建议初次培养时设置多个平行实验以提高成功率。

4.添加5ng/ml转化生长因子-beta(TGF-beta)以调节细胞表型和功能维持。

5.传代时用PBS轻柔洗涤2次后加入0.25%胰蛋白酶，室温作用2-3分钟收集细胞。