小鼠子宫平滑肌细胞

方法简介  实验室分离的小鼠子宫平滑肌细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法结合组织贴块法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠子宫平滑肌细胞经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠子宫平滑肌细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠子宫平滑肌细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，组织取材需保持血管/器官完整性

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、平滑肌细胞专用培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织(血管/器官平滑肌层)，用预冷PBS反复冲洗去除血液

仔细分离去除外膜和黏膜层，仅保留平滑肌层组织，剪碎至1-2mm3

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合液，37度消化40-60分钟，期间振荡2-3次

消化完成后过滤(70um+40um)，300g离心10分钟收集细胞沉淀

细胞悬液接种于培养皿中，采用差速贴壁法24小时后换液去除非贴壁细胞

原代培养要点

平滑肌细胞贴壁能力较强，接种后24-48小时可见贴壁细胞呈梭形生长

使用含20%FBS的DMEM/F12完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时进行传代

平滑肌细胞传代时使用0.25%胰蛋白酶消化5-10分钟，离心收集后重新接种

常见问题优化

细胞纯度不高：可采用药物筛选法(5-氟尿嘧啶20uM处理48小时去除非平滑肌细胞)

平滑肌细胞表型转换：控制传代次数在5代以内，培养基中保持适当FBS浓度(10-20%)

细胞生长缓慢：添加10ng/mL PDGF-BB可促进平滑肌细胞增殖

复苏前期试剂耗材准备：37℃水浴预热子宫平滑肌细胞完全培养基，准备无菌离心管、T25 培养瓶、PBS 缓冲液、胰酶‑EDTA 消化液，超净台紫外消毒 30min，核对冻存细胞标签，检查试剂无沉淀变质，确认细胞培养箱运行正常。

冻存细胞水浴快速解冻：从液氮罐取出冻存管，快速置于 37℃水浴，轻柔晃动冻存管，1‑2min 融化冻存液，留有微量冰晶，75% 酒精擦拭管外壁，移入超净台，缩短室温暴露时间，减少细胞损伤。

稀释离心去除冻存保护剂：将细胞悬液缓慢滴加到装有预温完全培养基的 15mL 离心管，轻柔混匀，900r/min 离心 5min，离心结束，小心弃去上清液，去除 DMSO 冻存保护剂，不要扰动底部细胞沉淀。

重悬制备单细胞悬液接种：加入子宫平滑肌细胞完全培养基，轻柔吹打沉淀，制备均匀单细胞悬液，细胞计数后按照推荐密度接种 T25 培养瓶，十字摇匀培养瓶，细胞均匀平铺瓶底。

培养箱恒温静置孵育：放入 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱孵育，24h 内不移动培养瓶，给平滑肌细胞充足时间完成贴壁伸展。

换液、细胞状态监控：复苏 24h 后更换预热新鲜完全培养基，吸弃旧培养基去除悬浮死细胞；每 2‑3 天换液，显微镜观察长梭形平滑肌细胞典型形态，排查细菌真菌污染。

传代消化收获细胞：细胞汇合 70‑80% 开展传代，弃培养基，PBS 清洗细胞，胰酶消化，镜下细胞皱缩变圆，立刻完全培养基终止消化，收集细胞离心重悬分瓶扩增；避免细胞 100% 长满，防止细胞表型发生转变。