小鼠脂肪间充质干细胞

方法简介  实验室分离的小鼠脂肪间充质干细胞采用胶原酶消化法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠脂肪间充质干细胞经CD29或CD44免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠脂肪间充质干细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠脂肪间充质干细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取材需严格无菌操作

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、MSC专用培养基/干细胞专用培养基、FBS、beta-巯基乙醇、L-谷氨酰胺

分离纯化步骤

从实验动物目标组织(骨髓/脂肪/脐带/牙髓等)中分离间充质成分

组织剪碎后经胶原酶消化(37度、2小时)，过滤获取单细胞悬液

采用密度梯度离心(Ficoll)纯化单个核细胞层

将细胞接种于培养皿中，间充质干细胞24-48小时贴壁，非贴壁细胞换液去除

贴壁细胞扩大培养至60-70%融合后，流式分选CD90+/CD105+/CD34-/CD45-细胞

原代培养要点

干细胞培养需使用专用培养基(含20%FBS的MSC培养基或DMEM/F12+20%FBS)

接种密度建议5x10^3-1x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，间充质干细胞呈梭形贴壁生长，融合达80%时传代

干细胞具有三系分化潜能，可在诱导培养基中向成骨/成脂/成软骨方向分化

常见问题优化

干细胞增殖缓慢：添加FGF-2(10ng/mL)和EGF(10ng/mL)可促进增殖

干细胞分化潜能下降：控制传代次数在3-5代以内，避免过度扩增

细胞纯度不高：采用流式分选CD90+/CD105+双阳性标记可提高纯度

小鼠无菌处死，酒精消毒体表，解剖摘取内脏周围、腹股沟脂肪组织，预冷 PBS 反复冲洗，彻底剔除血管、筋膜、淋巴组织。

把脂肪组织剪切成细小碎块，加入 I 型胶原酶消化液，37℃恒温振荡消化 45‑55min，使脂肪基质血管组分充分解离，培养基终止消化。

100μm 细胞筛过滤消化液，截留大块组织残渣，收集基质血管组分的细胞悬液。

细胞悬液 1000r/min 离心 5min，弃上层漂浮脂肪与上清，收集底部沉淀，PBS 重悬洗涤沉淀 2 次。

使用红细胞裂解液处理沉淀，裂解红细胞后再次离心洗涤，去除红细胞碎片，得到基质血管组分混合细胞。

脂肪间充质干细胞专用完全培养基重悬细胞沉淀，计数，接种于培养瓶，37℃、5% CO₂培养箱静置培养，依靠贴壁特性筛选间充质干细胞。

24h 彻底换液去除未贴壁的血细胞，后续每 48h 更换培养基；细胞长梭形旋涡状生长，汇合 80% 传代，可进行后续诱导分化实验。