小鼠支气管平滑肌细胞

方法简介  实验室分离的小鼠支气管平滑肌细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠支气管平滑肌细胞经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠支气管平滑肌细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠支气管平滑肌细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，组织取材需保持血管/器官完整性

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、平滑肌细胞专用培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织(血管/器官平滑肌层)，用预冷PBS反复冲洗去除血液

仔细分离去除外膜和黏膜层，仅保留平滑肌层组织，剪碎至1-2mm3

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合液，37度消化40-60分钟，期间振荡2-3次

消化完成后过滤(70um+40um)，300g离心10分钟收集细胞沉淀

细胞悬液接种于培养皿中，采用差速贴壁法24小时后换液去除非贴壁细胞

原代培养要点

平滑肌细胞贴壁能力较强，接种后24-48小时可见贴壁细胞呈梭形生长

使用含20%FBS的DMEM/F12完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时进行传代

平滑肌细胞传代时使用0.25%胰蛋白酶消化5-10分钟，离心收集后重新接种

常见问题优化

细胞纯度不高：可采用药物筛选法(5-氟尿嘧啶20uM处理48小时去除非平滑肌细胞)

平滑肌细胞表型转换：控制传代次数在5代以内，培养基中保持适当FBS浓度(10-20%)

细胞生长缓慢：添加10ng/mL PDGF-BB可促进平滑肌细胞增殖

无菌处死小鼠，解剖取出完整支气管，预冷 PBS 反复冲洗，剔除气管旁脂肪、血管，在体视镜下剥离支气管外层结缔组织以及内侧上皮黏膜，保留平滑肌层。

将平滑肌组织剪切成细小组织碎块，加入 II 型胶原酶消化液，37℃水浴消化 50‑60min，间断轻柔吹打，待组织松散后加入完全培养基终止酶解。

100μm 无菌细胞筛过滤悬液，滤除未消化组织残渣，收集过滤后的细胞悬液。

悬液 1000r/min 离心 5min，弃上清，PBS 重悬细胞沉淀洗涤 2 次，去除消化酶残留、破碎细胞碎片。

差速贴壁去除少量成纤维细胞杂细胞，短时孵育后弃去悬浮组分，保留已经贴壁的平滑肌细胞；也可采用组织块贴壁法辅助原代爬出。

支气管平滑肌细胞专用完全培养基重悬细胞，计数，调整合适密度接种，放入 37℃，5% CO₂培养箱静置孵育。

24‑48h 观察细胞贴壁生长，更换培养基清除悬浮死细胞；每 48h 换液，细胞呈现梭形、“峰谷” 生长特征，汇合度 80% 进行传代，优先选用低代细胞实验。